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1、食品微生物学 菌落总数的检测,GB 4789.2-2016,一、菌落总数的定义,GB标准： 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g(mL)检样中形成的微生物菌落总数。菌落总数不是指细菌总数！,二、检验程序,检样25g（mL）+225mL稀释液，均质,10倍梯度稀释,倾注平板计数琼脂（PCA）15-20ml,计数和报告,选取2-3个适宜稀释度的样品稀释液各1mL，加入无菌平皿中,培养361,48h2h,三、操作步骤,样品的处理，1.1、固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，8000r/min10000r/m
2、in均质1min-2min,或放入盛有225ml稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min,制成1:10的样品均液。1.2、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。,操作步骤,1.3、 用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100 的样品匀液 1.4 按1.3操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递
3、增稀释一次，换用一次1 mL无菌吸管或吸头。1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 -3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）, 每个稀释度分别吸取1 mL加入两个无菌平皿内。同时分别取1 mL稀释液加入两个无菌平皿作空白对照。1.6 及时将15 mL-20 mL冷却至46 的平板计数琼脂培养基（可放置于46 1 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。,四、培养,2.1 琼脂凝固后，将平板翻转，36 1 培养48h2h 。水产品30 1 培养72h3h.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL)，凝
4、固后翻转平板，按2.1 条件进行培养。,五、菌落计数,3.1可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony - forming units , CFU ）表示。3.2 选取菌落数在30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。,菌落计数,3.3其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算
5、半个平板后乘以2 ，代表一个平板菌落数。3.4当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。,六、结果报告,1 菌落总数的计算方法1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（1）计算： N=C/（n1+0.1n2）d（1） N 样品中菌落数；C 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1 第一个适宜稀释度平板个数；n2 第二个适宜稀释度平板个数；d 稀释因子（第一稀释度）。,结果报告,1.3 若所有稀
6、释度的平板上菌落数均大于300 ，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 ，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30-300 之间，其中一部分小于30 或大于300 时，则以最接近30 或300 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。,结果与报告,2.1 菌落数在100 以内时，按“四舍五人”原则修约，以整数报告。2.2 大于或等于100 时，第三位数字采用“四舍五人
7、”原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五人”原则修约后，采用两位有效数字。2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。2.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。,七、菌落总数的计算方法,菌落总数的计算方法,八、注意事项,1、平板计数琼脂不凝固： 放置于 46 1 恒温水浴箱中保温（ 4h），使用时摇匀一下。由于琼脂比重大，容易沉在瓶底部。2、出现蔓延菌落: 可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板。3、必须做空白对照：
8、如果空白对照试验，空白无菌落生长符合要求。培养条件： 一般样品361/48h2h，水产品（指原生态、未加工水产品）301/72h3h .平板计数琼脂温度不要过高： 温度高容易烧死平板里的细菌，使菌落总数减少。温度低琼脂容易凝固。,食品中菌落总数3M测试片法的检测,使用SN/T1897-2007行业标准 SN0168-1992出口标准,一、 3M菌落总数测试片的原理,细菌总数测试片是一种预先制备好的培养基系统，含有标准的培养基，冷水可溶性的凝胶剂和三苯四氮唑（TTC)指示剂，菌落在测试片上呈现红色或粉红色菌落，这样可增加菌落计数效果。,二、接种操作图示,1.将测试片置于平坦处，揭开上层膜,2.垂
9、直滴加1mL样液于测试片中央,接种操作图示,4.使用压板的凹面使样液均匀分布在圆形接种区域内，静置至少1min使胶凝固,3.允许上层膜直接落下，但勿滚动上层膜,三、培养,将测试片的透明面朝上置于培养箱内，可堆叠至20片，培养温度和时间为36 C 1C, 48h 2h。,四、菌落的判读,计数所有红点,菌落的判读,菌落密度很高时，整个测试片会变成红色或粉红色，将结果记为“多不可计”,圆形培养基的边缘有许多小的菌落，也记为“多不可计”,五、 菌落的估算,浅粉红色菌落,菌落的估算,六、菌落蔓延的读数,七、3M菌落测试片计数,1.计数范围，培养后，立即计数每个平板上的菌落数。25-250个菌落为合适范围
10、，如果不能立即计数，应将平板存放于-15，但不得超过7d.2. 计算方法有些不同，见标准SN 0168-92出口食品平板计数。,七、3M菌落测试片的注意事项,1.稀释度的选择，一定要选择合适的稀释度进行样品的检测。2. 防止菌落蔓延现象。24小时判读；减少叠放；使用较大的压板；提高稀释度。3.做空白试验。4.测试片压板以外的菌落不计数。,八、陆桥测试片操作要点,1、掀开上层透明膜,2、取1mL样液缓缓加入纤维垫上,陆桥测试片操作要点,3、5s后，待样液完全吸收,4、缓缓将透明膜盖回,陆桥测试片操作要点,5、接种完成，正置培养,九、陆桥测试片培养判读,1.培养条件：361/482h,2.菌落颜色：红色,陆桥测试片判读及计数,同国标GB4789.2-2010一样。,十、陆桥测试片的注意事项,1.样品制备按国标要求进行，选择合适稀释度即可。,2.整个操作需要在无菌条件下进行。,3.加入样品后薄膜轻轻放下即可，不要压盖无纺布部分，可压紧边缘薄膜。4.若薄膜放下时产生与空气连通的褶皱，则重新揭开薄膜，再次盖上。保证无连通空气的褶皱出现。5.做空白试验。,结束语,
