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1、DNA的复制和修复,遗传的中心法则,1958年Crick提出以DNA为中心的遗传信息的传递规律，即DNA贮存的遗传信息通过复制传给子代DNA，通过转录传给RNA，再通过翻译传给蛋白质。遗传信息传递方向的这个规律被称为中心法则。,DNA,RNA,蛋白质,复制,复制,转录,翻译,反转录,？,1970年Temin和Baltimore发现RNA病毒的RNA可通过反转录（逆转录）将遗传信息传给cDNA，也可通过RNA复制或RNA转录传给子代RNA，这是对中心法则的补充。1997年疯牛病和朊病毒的出现，预示蛋白质也可逆向将遗传信息向DNA传递。,复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系
2、列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。,几个基本概念：,逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。,翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。,转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。,中心法则图示,第一节 DNA的复制,复制：以亲代（母链）DNA为模板合成子代DNA的过程。,一、DNA的复制,（一）DNA复制是半保留复制,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，
3、一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念,半保留复制的证明：,Meselson 和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。,15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG
4、,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,半保留复制的意义,（二）DNA复制的起点和方式,复制子：基因组能独立进行复制的单位叫复制子，每个复制子都含有控制复制起始的origin和终止复制的终点（terminus）。,双向复制(bi-directional replication)、单向复制(un
5、idirectional replication)；复制叉(replication fork)或生长点(growing point)多复制子(multi-replicon),双向复制,单向复制,DNA复制的主要方式,大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制）（细菌DNA复制叉移动速度50kb/min，大肠杆菌染色体完成复制需要40分钟，然而，大肠杆菌每20分钟即可分裂一次。如何解释？),真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）复制叉移动速度为1kb3kb/min，高等真核生物一般复制单位长度为100200kb，每个复制单位在3060分钟完成复制，通常完成整个染色
6、体复制的时间要用68h。,一轮复制尚未完成，又启动新一轮的复制。,不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）,单向滚环式复制（噬菌体X174DNA单链环状）,三、半不连续复制 1、 体内仅存在5 3的DNA聚合酶2、 前导链与随从链（岗崎片段）,前导链,滞后链,冈崎片段,复制方向与解链方向一致,复制方向与解链方向相反,冈崎片段,DNA半不连续复制： 3 5方向母链为模板，新链5 3方向连续合成5 3方向母链为模板，新链5 3方向合成许多不连续的片段（岗崎片段）这种复制方式称之为半不连续复制。,RNA引物,DNA聚合酶不能催化两个游离dNTP在DNA
7、模板上聚合需要具3-OH的引物,RNA聚合酶能催化两个游离NTP在DNA模板上聚合提供3-OH引物最后被DNA聚合酶除去、补满，再由连接酶连接,减少突变，提高DNA复制的真实性,四、与DNA复制有关的酶和蛋白质,(一) DNA聚合酶：原料：四种脱氧核苷三磷酸 （dATP、dGTP dCTP dTTP)需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。 需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆 菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3 -OH. 合成方向：5 3 ,3 5 5 3 外切酶 聚合酶,N,C,5 3外切酶,小片段
8、,大片段（ klenow片段）,切除RNA引物损伤修复,校读功能,（常用的工具酶）,1、DNA聚合酶,聚合功能,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,(三）DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口,作用特点：,T4噬菌体的DNA连接酶不仅能连接双链DNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。,DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,(四)与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中),1、拓扑异构酶,拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。 除连环数不
9、同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。,2、解螺旋酶 （解链酶）,通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。,稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。,3、单链结合蛋白：,引发体可以沿模板链5 3方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量， n蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。,4、引物合成酶与引发前体,引物合成
10、酶：催化引物RNA的生成,引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n、n和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。,（五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图,五、 DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）,复制的终止：,复制的起始1、起始复合物的形成：称为引发2、RNA引物的合成,链的延伸：,复制原点oriC和原点的识别：,DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用ori C(或o）表示。大肠杆菌的复制原点ori C由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。,（一）复制
11、起始,1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、Dna A蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白HU、ATP参与下， Dan A蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4 、Dna B借助于水解ATP产生的能量在Dna C的帮助下沿5 3 方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（Dna G蛋白）开始合成RNA引物。,(二) 链的延长（冈崎片段的合成）,真核生物的冈崎片段为：100-200bp 原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp,DNA链的延伸,在DNA聚合酶的催化下，以四种5 -脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的
12、3端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。,冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:,(三) 复制的终止,顺时针终止陷阱,逆时针终止陷阱,Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp的序列，终止利用物质Tus可识别并结合，从而导致DNA复制的终止。,(四) DNA复制的精确性（高保真复制）,1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/1041/105。2、DNA聚合酶的35外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低1001000倍。3、DNA的损伤修复系统。,DNA复制必须具有高度精确
13、性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/1091/1010，即每1091010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制100010000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：,四、DNA的损伤与修复DNA修复的基础： 一条链有损伤 修复酶切除 以未损伤的链为模板 合成原来相同的序列,（一）造成损伤的原因,自发因素物理因素化学因素,紫外线损伤（共轭双键）电离辐射损伤（X线/线）亚硝酸盐 C U5-溴尿嘧啶 5-BU A 氮芥类 烷化剂羟胺 C- A,G,G,羟胺,（二）修复机制,光修复 （低等生物）不需光复活酶需光复活酶,（photoreacti
14、vation repair）嘧啶单体 嘧啶二聚体嘧啶单体 嘧啶二聚体 光复活酶（+） 蓝光,280nm,239nm,1、直接修复,光复活/光修复光复活酶识别TT 与之形成复合物吸收光能使TT解开成为单体酶从复合物中释放仅作用于UV形成的产物,O6甲基鸟嘌呤直接被修复,2、切除修复（excision repair） （1） UV特异核酸内切酶切除 DNA聚合酶填补、修复 DNA连接酶连接（2） 人体重要的修复方式 ，对多种损伤均能起修复作用。 （3）缺乏UV特异核酸内切酶 着色性干皮病,切除修复发生在复制之前,核苷酸切除修复,dUTP酶可以分解dUTP为dUDP和dUMP胞嘧啶C自发脱氨氧化生成
15、尿嘧啶U尿嘧啶-N-糖苷酶,腺嘌呤脱氨成次黄嘌呤次黄嘌呤-N-糖苷酶烷基化修饰的碱基被糖苷酶除去,AP位点（apurinic/apyrimidinic site）无嘌呤或无嘧啶位点,碱基切除修复,DNA糖苷酶识别切除改变的碱基 核酸内切酶切除磷酸二酯键 DNA聚合酶填补 DNA连接酶连接,DNA糖苷酶具特异性识别-DNA中的异常碱基水解-异常碱基与脱氧核糖间糖苷键 使其脱落,DNA碱基的组成为何是“T” ？（1）DNA中的C容易突变成U（2）尿嘧啶DNA糖苷酶识别DNA中的U（3）若DNA中存在U，无法区别突变U和正常U DNA中T的存在增加遗传信息的稳定性 RNA中的U：数量多/半衰期短/经
16、济,碱基切除修复,DNA损伤,核苷酸切除修复,3、错配修复耗能的过程,DNA错配修复的模型,4、重组修复（recombinational repair）,二聚体后起始途径复制继续子链缺口经重组由母链相应片段填补 RecA 蛋白具有交换DNA链活力母链缺口再合成 二聚体可被切除修复，如未被去除，将随多次重组修复而逐渐稀释。,复制后修复,5、易错修复,细胞DNA受到严重损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，能引起一系列复杂的诱导效应SOS反应。SOS反应诱导的修复系统包括：避免差错的修复(如切除修复和重组修复）易错修复（诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶）,SOS反应诱导缺乏校对功能的DNApol、
17、引起校对系统的松懈 RecA基因产物LexA蛋白自身水解（蛋白酶活性被激活）SOS系统开放：修复系统的酶表达,LexA基因表达也增加使SOS反应可迅速逆转,SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物，是生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。SOS反应造成大量的突变体。因此，SOS可能在生物进化中起重要的作用。,大多数在细菌中诱导产生SOS反应的作用剂，对高等生物都是致癌的，因此，目前有关致癌物的一些简便的检测方法即是根据SOS反应原理设计而设计的。,五、DNA突变（一）突变的类型,点突变类型结果,转换-同型碱基颠换-异型碱基启动子/剪接信号 影响整个基因功能编码序列 蛋白质功能改变中性变化 AA
18、变化，功能不变静止突变 碱基变，AA不变,1.碱基对的置换,缺失插入倒位,一个碱基/一段核苷酸/整个基因一段原来没有的碱基/核苷酸序列DNA链内部重组，一段方向颠倒,2.移码突变,（二）诱发基因突变的因素,根据突变发生的原因可将突变分为:自然条件下未经人工处理而发生的自发突变（spontaneous mutation）经人工处理而发生的突变诱发突变（induced mutaion）诱发突变的各种内外因素统称为： 诱变剂（mutagen）,H N,NH,O,Br,o,N,NH,O,Br,OH,HN,NH,O,O,CH3,酮式5-BU 烯醇式5-BU 胸腺嘧啶,1、碱基类似物 5-溴尿嘧啶（5-B
19、U),与G配对,与A配对,化学因素,烯醇式 5- BU与G的配对,N,N,O,Br,O-H,H-N,H-N,H,N,O,N,N,5-BU引起的 A-T G-C 转换,A-T,第一次复制,A-T,A-BU,（酮式）,第二次复制,A-BU（酮式）,G-BU （烯醇式）,第三次复制,A-BU,G-BU,G-C突变,A-T,2、碱基修饰剂,脱氨剂：诱导碱基脱氨、点突变 亚硝酸钠、亚硫酸氢钠羟胺 作用于C，生成4-羟胺胞嘧啶，而与A配对烷化剂，使DNA上N烷基化，如G 7N烷基化，另外，可引起DNA交联，或者碱基从DNA上脱离,A,I与C配对,脱氨,C,G,U与A配对,X仍与C配对,脱氨,脱氨,芳基化剂引起的DNA损伤可与DNA形成共价化合物,OH,HO,HO,G NH,苯并芘,苯并芘二羟环氧化物与鸟嘌呤加合物,3、嵌入染料诱发的突变一类较强的诱变剂,N,NH2,H2N,原黄素的结构原黄素插入母链两个碱基之间，结果多一个核苷酸；插入子链两个碱基之间，正常碱基不能插入，结果少一个核苷酸后果：引起移码突变,4、紫外线和电离辐射,紫外辐射：产生相邻碱基二聚体，T=T最常见电离辐射：直接作用于DNA分子 间接作用（辐射产生的活性氧） 碱基损伤、糖环断裂、DNA链断裂或交联生物因素：可移动基因成分 插入或切断基因、病毒、转座子,物理因素,生物因素,
