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1、DNA Barcoding在药用植物鉴定中的应用,DNA Barcoding in the identification of medicinal plants,刘 滨 李宏富,DNA条形码技术(DNA barcoding)是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段(DNA barcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统,它可以对物种进行快速的自动鉴定。DNA Barcoding的概念由加拿大动物学家Paul Hebert首次提出。,Paul Hebert等对动物界包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13 320个物种的线粒体细胞色素c氧化酶亚基
2、1（Cytochrome coxdase I，CO I）基因序列比较分析，除腔肠动物Cnidaria外，98%的物种遗传距离差异在种内0%-2%，种间平均可达到11.3%，据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种；他们将超市用以区分成千上万种不同商品的条形码概念引入，把这种小片段基因序列称作物种的DNA条形码（DNA barcodes）并提出为全球生物编码的计划。,DNA条形码的原理,DNA是生物的遗传信息载体。遗传基础的不同，决定了生物的多样性。由于每种生物物种的DNA序列都是唯一的，就给DNA条形码提供了物质基础，每个位点上都有A、T、G、C 4种选择。由于部分碱基的保守性，几十个碱基的长
3、度不能提供足够的编码信息，因此目前的DNA条形码分析都是基于几百个碱基长度的DNA序列。,DNA条形码的标准,Kress等(2005)和Taberlet等(2007)提出了理想的DNA条形码标准：(1)具有可以区分物种的足够变异和分化，同时种内变异必须足够小；(2)有高度保守的引物设计区以便于设计通用引物；(3)片段足够短，以便于DNA提取和PCR扩增，尤其是对部分降解的DNA的扩增。,DNA条形码的优点,生命条形码联盟(consortium for the barcode oflife, CBOL)阐述了DNA条形码的优点：(1)以DNA序列为检测对象，其在个体发育过程中不会改变。同种生物不
4、同生长时期的DNA序列信息是相同的，即使经过加工，形态发生变化，而DNA序列信息不会改变，较之传统的方法，扩大了检测样本范围；同时样本部分受损也不会影响识别结果。(2)可进行非专家物种鉴定。该技术是可机械重复的，只要设计一套简单的实验方案，经过简单培训的技术员即可操作。,DNA条形码的优点,(3)准确性高。特定的物种具有特定的DNA序列信息，而形态学鉴别特征会因趋同和变异导致物种的鉴定误差(4)通过建立DNA条形码数据库，可一次性快速鉴定大量样本。分类学家新的研究成果将不断地加入数据库，成为永久性资料，从而推动分类学科更加快速深入地发展。,操作及分析方法,1.提取目的基因 2.PCR3.电泳4
5、.结果分析,植物DNA的提取,1.2g新鲜植物叶片，液氮中研磨尽量越细越好； 2.至50ml离心管中，加8ml细胞提取液，混匀，65水浴保温20min；3.取出离心管，加入2.5ml 5mol/L KCl溶液，混匀，冰浴20min；4.4000r/min20min，并转移上清至另一50ml离心管；5.加等体积酚/氯仿混匀，12000r/min5min，取上清；,6.加等体积氯仿，混匀，12000r/min5min，取上清；7.加入0.6-1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀8.离心获得沉淀，70%乙醇洗3次。干燥沉淀（不要太干，否则DNA不易溶解）。9.加入200L TE缓冲液，溶解DNA；1
6、0.上清液就是所需的目的基因DNA。参考：分子生物学实验指导（第二版） 高等教育出版社 主编：魏群,聚合酶链式反应（PCR）,1.PCR技术的创建2.PCR的原理3.PCR的反应体系和方法4.PCR技术的近现代运用,基因组DNA,引物,DNA聚合酶,DNA片段体外扩增,PCR技术的创建,Kary B. Mullis（穆利斯（美）,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国
7、Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,Kary B. Mullis（1944）,http:/,三篇重要论文,The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction (Scientific American, 1990,262(4):56-61, 64-5 )Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase (Science,1988,239(48
8、39):487-91 ) Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods in Enzymology, 1987,155:335-50 ),生物样品,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,1983年,94变性,50-65退火,XX延伸,94,55,37,Taq DNA聚合酶（thermu
9、s aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术,72,94,55,PCR循环,TaqDNA聚合酶的发现，使整个PCR过程更加的简单化，让整个反应省事、省力、省财。不用在关键环节（变性-褪火-延伸重复）不断的加入反应底物。,PCR技术的原理,1 PCR技术的基本原理,无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循
10、环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。,DNA的变性和复性,加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,2 PCR技术的特点,1 ）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,2 ）特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异
11、性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,引物设计原则：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。,3）操作简便易行,PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选
12、;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。,PCR的反应体系和方法,PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。,总体积 50-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Pr
13、imer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶,1 反应体系,PCR技术的基本过程(1),模板DNA dNTP 引物Buffer,预变性,模板DNA dNTP 引物Buffer,TaqDNA聚合酶,94oC5,2 基本过程,PCR技术的基本过程(2),Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer,循环仪,9455 72 ,Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer,72 57 min,循环2535次,PCR技术的基本过程(3),1）PCR反应成分,（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/1
14、00L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,3 PCR反应条件,（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L
15、反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2）循环参数变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,（3）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加,经典循环参数（500bp以内）,94 30s 55 45s72
16、1min,94 5min,30次,72 7min,42 forever,全新4通道实时荧光定量PCR仪,普通梯度PCR仪,PCR技术的应用,1) 基因克隆,基因工程产品,5,5,Bam H I,Bam H I,Bam H I,Bam H I,限制性核酸内切酶,2)基因检测,A,内源性病变基因,正常人,A,病 人,病原微生物基因,正常人 (-),病 人 (+),遗传病的诊断,基因缺失、插入或置换等,地中海贫血,珠蛋白链合成不平衡,A,正常人,病 人,正常,病人,ASO探针法,A,C,T,G,ASO探针,正常,病人,PCR-ASO检测基因点突变:主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合
17、成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交,探针杂交,NC膜,探针,正常人,突变纯合子,突变杂合子,PCR-RFLP法：,限制性内切酶,恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）,Ras基因,突变,限制性内切酶,正常,突变,电泳,HLA系统基因分型,PCR-RFLP法,PCR-SSO法,PCR-SSCP,PCR-SSP,3)基因配型,PCR-SSP,1 2 3 4 5 6 7 8,PCR,1 2 3 4 5 6 7 8,引物特异性,（序列特异性引物-PCR技术 ）,4）基因鉴定,女性,男性,Y引物,PCR,男性 女性,法医学分析,个体识别、亲缘鉴定方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 PCR-ASO PCR-V
18、NTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序,PCR-VNTR多态性检测,PCR；电泳检测,（VNTR：数目可变的串联重复序列 ）,琼脂糖凝胶电泳,1.操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；2.凝胶结构均匀，含水量大，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附微笑，因此图谱清晰，分辨率高，重复性好；3.琼脂糖凝胶无紫外吸收，所以电泳过程和结果可以直接用紫外检测和定量分析；4.电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测量，制成干膜可以长期保存。,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,1.在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 2.化学性能稳定，与被分离物不起化学反应；3.对PH值和温
19、度变化稳定；4.几乎无电渗作用，只要Acr（丙烯酰胺）纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；5.凝胶孔径可调节，跑胶过程更加自由；6.样品不已扩散，且用量少；7.比琼脂糖凝胶电泳拥有更高的分辨率,现 嫌1 嫌2 嫌3,父 父 子 母,DNA条形码在植物中的研究现状,为了寻求一种通用的植物条形许多学者进行了积极的探索，已出了多种条形码片段或组合方但至今仍没有达成明确的共识。条形码联盟(CBOL)最初建议了6段作为候选片段：matK、rpoC1、B、accD、nhdJ和YCF5。,Kress等(2005)通过对53科88属99个物种的9个质体基因片段(trnK-rps16、trnH-psbA、
20、rp136-rps8、atpB-rbcL、ycf6-psbM、trnV-atpE、trnC-ycf6、psbM-trnD和trnL-trnF)和核基因ITS序列进行分析，提出了片段组合方案,并预测ITS+trnH-psbA组合将在有花植物(flowering plants)中有较广泛的应用价值。,DNA条形码在植物中的研究现状,现有的研究报道了在2种组合方案中选择片段的方法，分别是Chase等(2005)提出的交通灯法(traffic light approach)和Newmaster等(2006)提出的等级(tier)分类法。,DNA条形码在植物中的研究现状,2007年9月，在第二届国际生命
21、条形码大会上，总结了5种片段组合：Chase等(2007)提出的rpoC1+rpoB+matK或rpoC1+matK+trnH-psbA；Kress和Erickson(2007)提出的rbcL+trnH-psbA，其可以对陆生植物进行识别和鉴定。韩国植物学家Ki-Joong Kim等提出的matK+atpF-atpH+psbK-psbI或matK+atpF-atpH+trnHpsbA(Pennisi,2007),DNA条形码在植物中的研究现状,DNA条形码在药用植物鉴定中的应用展望,DNA条形码已经在动物中得到广泛应用，在植物中的研究也正在快速开展，这将有助于非分类学专业工作者对有关材料进行快
22、速、准确的鉴定，尤其是对于药材的鉴定。由于各片段(尤其是多片段的组合选择)在不同类群中的应用效果不同，目前尚未获得一致的植物条形码标准片段，因此，当前的研究热点仍然是选择和评价可能的条形码片段，进行更大规模的分析和整体评价。,DNA条形码在药用植物鉴定中的应用展望,DNA条形码有助于非分类学专业工作者对有关材料进行快速、准确的鉴定，尤其是对于药材的鉴定。由于各片段(尤其是多片段的组合选择)在不同类群中的应用效果不同，目前尚未获得一致的植物条形码标准片段，因此，当前的研究热点仍然是选择和评价可能的条形码片段，进行更大规模的分析和整体评价。,DNA条形码在药用植物鉴定中的应用展望,目前，DNA条形
23、码以其快速、准确和自动化，在生物物种鉴定领域的研究方兴未艾，而在药材鉴定中的应用尚处于萌芽状态。如能将DNA条形码用于市场品种混乱的多来源药材的鉴定，弥补其在药材质量评价方面的不足，可形成能够全面反映生药的生物基原、质量、产地等信息的DNA条形码系统；该系统不仅能够用于药材的鉴定与质量评价，还可以探讨原植物间的亲缘关系及系统发育。,DNA条形码在药用植物鉴定中的应用展望,远景预期技术成熟后可形成供企业使用的药材生产标准，在进货时以DNA条形码系统进行质量控制，在药材成品上标识DNA条形码，质检部门可对其进行验证判断真伪及是否符合生药质量标准。,DNA条形码在药用植物鉴定中的应用展望,随着DNA条形码技术的飞速发展，可以预见地球上几乎所有生物种类都将具备唯一的DNA条形码。该技术有着巨大的应用潜力，不久的将来，手持式快速物种鉴定设备的投入使用将给药材的快速鉴定工作带来巨大的便利。,谢谢,
