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1、内 容,为何要检测EGFR突变EGFR突变类型及意义标本因素对突变检测的影响突变检测流程与方法概述ARMS试剂盒检测EGFR突变非肿瘤组织标本检测EGFR突变进展,具有EGFR基因敏感突变者TKI疗效显著,1JCO 2006; 2-5ASCO 2006; 6ASCO 20077Mok TS et al, NEJM 2009; 8Maemondo M et al. NEJM 20109Mitsudomi T et al. Lancet Oncology 2010,70.4%,EGFR基因突变检测在临床应用的意义(1/2),为何要检测EGFR突变 (2/2),IPASS: 根据突变状态的疗效分析,
2、0,4,8,12,16,20,24,Time from randomisation (months),0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,Probabilityof PFS,Gefitinib EGFR M+ (n=132)Gefitinib EGFR M- (n=91)Carboplatin / paclitaxel EGFR M+ (n=129)Carboplatin / paclitaxel EGFR M- (n=85),Gefitinib EGFR M+ (n=132)Gefitinib EGFR M- (n=91)Carboplatin / paclitaxel EGFR
3、 M+ (n=129)Carboplatin / paclitaxel EGFR M- (n=85),EGFR基因突变检测概念,EGFR突变检测指肿瘤组织中编码EGFR基因的DNA突变状态检测并不是：EGFR基因DNA拷贝数的检测（FISH法）EGFR蛋白表达量的检测（IHC法）。,X,Nature Review 2007, 7:169,NSCLC中EGFR酪氨酸激酶区突变种类,EGFR突变类型与吉非替尼治疗敏感性,Mok et al., 2008Kim et al., 2008Hirsch et al., 2006AZ In-House Data - Unpublished,标本采集及病理评
4、估,DNA 抽提及质控,检测报告,EGFR突变检测,ARMS,测序法,其它方法,EGFR 突变检测流程,EGFR突变检测中的相关角色,患者,临床医生,胸外科医师,内镜医师,收集肺癌组织标本,病理科医生,准备样本,实验操作及结果分析,实验室人员,报告结果给临床医生,肿瘤科医生放疗科医生呼吸科医生,标本因素对EGFR突变检测的影响-肿瘤组织特点-,遗传异质性,对检测方法敏感度有较高要求,用于EGFR突变检测的标本,肿瘤组织目前最可靠的标本；其它样本： 外周血（血浆、血清） 细胞学 （胸水、痰液细胞学） 支气管刮取物,仍需进一步研究确定这些样本在临床实践及诊断中的应用,标本因素对EGFR突变检测的影
5、响-组织标本种类-,对检测方法有相应要求，组织标本及DNA质控尤其重要,肿瘤组织标本的采集及病理评估,肿瘤组织标本,病理学评估,组织切片,非小细胞性肺癌诊断及类型肿瘤细胞比例肿瘤细胞总数标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤细胞,H&E 染色片用于病理评估白片用于提取DNA建议最少切片数：-手术标本，5 m X4-小活检标本，5 m X8,组织标本来源手术标本支气管下活检经皮穿刺活检 标本处理及贮存新鲜冻存：液氮或-80CFFPE,DNA提取及质控,推荐用QIAGEN或类同试剂盒提取DNA紫外分光光度计：适合新鲜组织DNA质控测定总量（OD260）及DNA纯度（OD260/280）qPCR：FFPE来源D
6、NA的最可靠质控方法检测可扩增的DNA片断评估是否存在PCR抑制剂,DNA 10倍稀释后,ME-PCR/ Sequencing,O,= Transfer product /add reagent/ open tube,PCR: Real-timeDetection,PCR,Clean-up,Sequencing Rxn,Capillary Sequencing,PCR,PCR,Clean-up,Sequencing Rxn,CapillarySequencing,PCR,Hetero-duplex,CapillaryElectro-phoresis,ARMS & PNA-LNA clamp,P
7、CR/ Sequencing,Nested PCR/ Sequencing,PCR/HRMA/dHPLC,PCR/RFLP,PCR,RFLP,Electro-phoresisSizing,PCR,PCR,Clean-up,Sequencing Rxn,CapillarySequencing,RFLP,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,TaqMan,Clean-up,O,Clean-up,O,Clean-up,O,O,O,O,PCR,SURVEYORcleavage,dHPLCSizing,O,Confirmation by sequencing,PCR/SURVEYOR,PCR,
8、Clean-up,Pyro-sequencing Rxn,Pyro Sequencing,O,O,1,2,3,4,5,6,Steps,7,突变检测的各种方法：流程与敏感度,Confirmation by sequencing,O,Confirmation by sequencing,O,O,O,1%,10%,3-10%,10%,3-12%,2030%,2030%,1%,PCR: Real-timeDetection,10%,直接测序法流程及数据分析,PCR*,纯化,测序反应,测序仪毛细管电泳,纯化,数据分析,EGFR deletion,EGFR L858R,电泳质控,组织标本,DNA,*PCR
9、是关键：-特异性-产物长度-必要时巢式-建议通用测序引物,ARMS法基本原理,等位基因特异性PCR + 荧光探针= ARMS方法,DNA,ARMS反应,实时定量 PCR,ARMS法操作流程及数据解读,数据分析,内参信号 (HEX),突变信号: + -内参信号: + +,标本 1（突变阳性）,标本 2（突变阴性）,突变信号 (FAM),组织标本,内参信号 (HEX),DxS ARMS 与 ADx ARMS,SFDA认证,应用比较：DxS ARMS 与 ADx ARMS（与张绪超/吴一龙教授等合作共同完成）,检测结果比较,结论：ADx ARMS与DxS ARMS具有相近的敏感性和特异性 !,突变判
10、读,测序法与ARMS法比较,测序法与ARMS法应用实例,F Hirsch, et al. JCO 2006C Zhu, et al. JCO 2008T Mok, et al. Discovery Med 2009,非肿瘤组织标本检测EGFR突变进展,用外周血游离DNA(cfDNA)检测肿瘤EGFR突变 用细胞学标本检测肿瘤EGFR突变-癌性胸水-经支气管细针穿刺样本,用外周血cfDNA检测肿瘤EGFR突变,肿瘤病人外周血cfDNA特点：cfDNA血浆中浓度可以很低 (10-1200ng/mL)cfDNA片段很短(180bp)，可能多由凋亡产生肿瘤释放的cfDNA在总cfDNA中的比例可以很低
11、 (3%-93%),核心问题：应该用哪种血标本提取cfDNA，血浆还是血清？哪种方法适合用于cfDNA突变检测？用cfDNA进行突变检测的敏感性与特异性如何？,用外周血cfDNA检测肿瘤EGFR突变的文献报告,敏感性: 75%; 特异性: 97%.（注：肿瘤组织为测序法检测）,ARMS法检测cfDNA中EGFR突变,Kimura et al. Br J Cancer 2007; 97(6): 778-784,数字PCR检测cfDNA中EGFR突变,敏感性: 79%; 特异性: 100%.（注：肿瘤组织为数字PCR及测序法检测）,Yung et al. Clin Cancer Res 2009;
12、15(6): 2076-2084,PCR/dHPLC检测cfDNA中EGFR突变,敏感性: 82%; 特异性: 90%.,Bai et al. J Clin Oncol 2009; 27:2653-2659,用血浆还是血清提取cfDNA？（unpublished data）,cfDNA得率比较,血清cfDNA,血浆cfDNA,EGFR缺失突变（+）,EGFR缺失突变（+）,EGFR缺失突变（-）,EGFR缺失突变（+）,血浆似乎比血清好！,突变富集PCR+测序,哪种方法更适合用于cfDNA突变检测？（unpublished data）,直接测序不适合 ARMS法、数字PCR、dHPCL均有高检
13、出率报道，但须更多数据支持,WANG et al. Chinese Medical Journal 2011;124(6):887-891,测序与ARMS,用癌性胸水检测EGFR突变,*用肺腺癌胸水中细胞检测EGFR突变,* Kimura et al. Cancer Sci 2006; 7 (7):642-648,EGFR突变检出率: ARMS法35%；测序法13%,*用胸水中细胞及无细胞液同时检测EGFR突变,EGFR突变检测: 细胞成份与无细胞液均可，突变富集PCR法比测序法敏感,*Zhang et al. Lung Cancer 2008; 60:175-182,用胸水检测肿瘤EGFR突
14、变需要敏感方法用胸水中细胞及无细胞液均可检测EGFR突变，且检出率基本相同目前缺少胸水与肿瘤组织直接对比（配对样本检测）数据，故对其敏感度与特异性尚无结论,经支气管细针穿刺样本检测肿瘤EGFR突变,EGFR突变检出率: ARMS法29%；测序法14%CHEST 2007; 131(6): 1628-1634,用细针穿刺样本检测肿瘤EGFR突变需要敏感方法ARMS法比测序法更适合目前缺少小活检肿瘤组织与外科手术切除肿瘤组织直接对比（配对样本检测）数据，故对其敏感度与特异性尚无结论,小结：如何成功开展EGFR突变检测,了解你的标本-新鲜/冰冻组织FFPE组织-手术标本小活检标本选择合适的方法-ARMS是目前较敏感快速方法，且容易开展-测序是传统的方法，但敏感度有限，过程复杂，不易普及做好组织标本及DNA质控是关键非肿瘤组织标本的有效利用-在无肿瘤组织情况下，外周血cfDNA、胸水及细针穿刺等细胞学标本均可用于检测EGFR突变，但其确切的敏感度与特异性尚需进一步探索-必须选择足够敏感的方法,谢 谢 ！,
