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1、HPV检测技术及临床应用,内容,HPV检测技术的诞生背景HPV检测临床应用的进展HPV检测主要的技术及特点硕世21HPV分型定量检测的优势,HPV与宫颈癌关系的确立,Professor Harald zur HausenNobel Prize for Medicine 2008,1976年：Harald zur Hausen在宫颈癌及疣体患者中发现了HPV DNA；1984年：Harald zur Hausen从宫颈癌患者中克隆了HPV16型和18型病毒。,“The first one who demonstrated HPV-DNA sequences in cervical cancer
2、biopsies and cervical cancer cell lines.”,Cytology Reduced Cervical Cancer Incidence but Unmet Need Still Exists,http:/seer.cancer.gov/archive/csr/1975_2010/results_merged/sect_05_cervix_uteri.pdf: SEER 9 Incidence & U.S. Mortality 1975-2010, All Races, Females. Rates are Age-Adjusted. (accessed 3/2
3、5/14),细胞学减少了宫颈癌的发生率，但尚未满足的需求依然存在,对于CIN2及以上病变检测的敏感性，细胞学低于HPV DNA检测1精确性差：不同的细胞病理学医生之间或实验室之间对结果的判读，存在高度的变异2只能分辨已经处于癌或癌前病变的妇女，不能分辨具备发展为癌前病变的风险妇女,Castle PE, et al. Lancet Oncol 2011; 12:880890 plus supplementary tables.Wright TC et al. Int J Cancer. 2013 Oct 7. doi: 10.1002/ijc.28514. Epub ahead of print
4、,单独使用细胞学的局限性,细胞学假阴性率高女性确诊为浸润癌（ICC）的筛查史,1. Leyden WA, et al. J Natl Cancer Inst 2005; 97:675683; 2. Andrae B, et al. J Natl Cancer Inst 2008; 100:622629.,细胞学临床敏感性明显更低于HPV DNA检测,Whitlock EP, et al. Ann Intern Med. 2011; 155:687697, W2145.,Studies performed in developed countries in women 30 years and
5、older.,平均增加了35.7%,CIN2的检测敏感性 (%),细胞学缺乏精确性细胞学的判读重复性差,质控（ QC ）评审诊断重读了4948份液基细胞学片子,原始诊断结果,Re-read of 4948 Liquid-based Cytology SlidesStoler M and Schiffman M, JAMA. 2001;285:1500-1505,ASC-US和HSIL 的结果判读一致性最差,* For CIN2Wright et al. Int. J. Cancer, 2014; 134(8):1835-43,ATHENA 临床研究: 细胞学在各实验室间检测的变异很大,Khan
6、 et al. J Natl Cancer Inst. 2005; 97:1072-1079.,随访月数,发展为CIN3的百分比,30岁，细胞学为NILM，10年CIN3的累计风险,13,229 women aged 30 years, according to oncogenic HPV status at enrollment,细胞学不能像HPV DNA检测那样，可预测风险HPV DNA检测确定了妇女随着时间CIN3以上病变的发展风险,内容,HPV检测技术的诞生背景HPV检测临床应用的进展HPV检测主要的技术及特点硕世21HPV分型定量检测的优势,1970s豪森提出HPV感染与宫颈癌有关,
7、美国宫颈癌死亡人数下降85%1941年，死亡26000人2010年，死亡4210人。,宫颈癌筛查重大进展时间表,1. HPV联合细胞学筛查（2012年ASCCP/ACS/ASCP）,Saslow D, Solomon D, Lawson HW et al. Am J Clin Pathol. 2012 Apr;137(4):516-42.,HPV检测联合细胞学筛查（30岁及以上）,ASCCP，American Society for Colposcopy and Cervical Pathology：美国阴道镜和宫颈病理学会CSCCP，China Society for Colposcopy
8、and Cervical Pathology：中国阴道镜和宫颈病理学会LSIL，Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion)：低度鳞状上皮内病变,Saslow D et al, Journal of Lower Genital Tract Disease, 2012,HPV检测+细胞学,细胞学 LSIL,HPV+ & NILM,HPV- & ASC-US,HPV- & NILM,HPV+ & ASC-US,阴道镜,间隔5年筛查,ASCCP推荐：间隔3年筛查CSCCP推荐：间隔1年筛查,HPV16/18+,HPV16/18-,HPV16/18分型 立即,重
9、复联合检测间隔12个月,HPV+ 或 ASC,HPV- & NILM,阴道镜,间隔3年筛查,重复联合检测间隔12个月,2. 21岁及以上女性细胞学ASC-US的分流管理 (2013年ASCCP指南推荐),意义不明的非典型鳞状上皮细胞（ASC-US）,阴性,ASC,常规筛查（3年内细胞学检查）,阴道镜 不充分阴道镜检查未观察到上皮病变，首选颈管取样 充分阴道镜检查转化区有上皮病变，可接受颈管取样,HPV阳性,HPV阴性,重复联合检测间隔 3年,参照ASCCP指南管理,重复细胞学，间隔 1年（可接受）,HPV检测（首选）,L. Stewart Massad, et al, Journal of L
10、ower Genital Tract Disease, 2013.,3. 25岁及以上女性HPV检测宫颈癌一线初筛 (2016年ACOG指南推荐),ACOG，American Congress of Obstetricians and Gynecologists：美国妇产科医师学会NILM，negative for intraepithelial lesion or malignancy：未见上皮内病变或恶性病变ASC-US，Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance：意义不明的非典型鳞状上皮细胞,2016 ACOG practic
11、e bulletin，Number 157.,HPV 检测预防宫颈癌（欧洲试验结果）,4 个欧洲随机试验，分别在瑞典、荷兰、英国和意大利进行包括 176,464位20-64岁妇女随访的中位年数为6.5 (1,214,415 人-年)HPV 初筛相比细胞学，减少了宫颈癌的发生率,Ronco et al. Lancet，2014,HPV检测筛查宫颈癌的预防效果优于细胞学,Ronco et al. Lancet，2014,汇总四个随机对照试验的宫颈癌发病率：细胞学（对照组）与HPV检测（试验组）,美国ATHENA研究,研究人群：美国46,887位接受常规筛查的妇女 (其中32,260位 30 岁，4
12、1955位 25 岁)受检者同时妇科检查，液基细胞学检查，HPV检测和基因分型所有HPV (+) 和/或 细胞学 (+)；和选取部分HPV (-) / NILM（未见上皮内细胞病变）的人群行阴道镜检查,比较不同筛查策略效能（25岁及以上女性）,权衡CIN3+的检出率和阴道镜转诊率,Wright et al. Gynecol Oncol 2015,*混合策略是指25-30岁细胞学筛查策略结合30岁及以上HPV检测联合细胞学筛查策略,宫颈癌发生率（每100,000）,年龄组,* http:/seer.cancer.gov/csr/1975_2010/,SEER 肿瘤登记(1975-2010)*,美
13、国宫颈癌的发病率25 34 岁时快速上升期,SEER（Surveillance, Epidemiology, and End Results ）,Presented to FDA panel, 12 March 2014,Age Group,40%,30%,20%,10%,0%,25-29,40-49,30-39,50,CIN3病例（%）,21-24,28%,17%,10%,37%,8%,25%,N=22,006Women,N=6647Women,28% 的CIN3 病例发生在25-29 岁年龄段,42.7,53.3,61.7,72.2,细胞学漏检了25-29年龄段的大多数 CIN3病例,Pe
14、rcentages shown are for hrHPV+ women with CIN3, N=252Huh W, et al. 27th International Papillomavirus Conference, Berlin, Germany, September 1722, 2011, OP-229.,比率CIN3 (%),年龄,4. 宫颈病变术后的追踪与管理,2013年ASCCP指南推荐的CIN2, 3 管理*,*如果妊娠或年龄在2124 岁的女性，管理选择可能会有所差异,术前、术后的检测提示病灶是否清除干净术后 6、12 个月复查HPV检测，若结果仍为阳性，提示有残留病灶或
15、复发可能CIN 转归的预测，若 CIN 不伴HPV ，预示良性转归,5. HPV分型及定量检测的临床应用,预测病变的发展或转归对于非CIN的HPV检测阳性患者，根据病毒型别及载量的变化，监测患者HPV是自限性感染（一过性感染）或持续性感染，预测患者病变的发展或转归风险提示高病毒载量预示着患者自我消退的时间更长以及潜在的病变风险更高，提示临床需进行更为积极的管理指导疫苗的使用和研究2006年FDA批准了第一代四价抗HPV疫苗（抗HPV16、18、6、11），2014年FDA又批准了9价抗HPV疫苗（抗HPV16、18、31、33、45、52 、 58 、6、11），推荐对已有性生活的人群，在接种
16、疫苗前进行HPV基因分型检测,Shen G, Chen J, Wang Y, et al, 2014. Jonas Lefevre,Catherine Hankins ,et al. 2004. 廖秦平, 赵健, 2010.,病毒载量是宫颈病变发生发展的关键因素,随着HPV病毒载量的增加，细胞异常的比例显著增加,Bigras G, Marval F D. British Journal of Cancer, 2005, 93(5):575-81.,病毒载量越高，持续感染的时间越长,病毒载量可预测病毒的清除或疾病的进展,Trevisan A, Schlecht N F, Ramanakumar
17、A V, et al. Journal of General Virology, 2013, 94(Pt 8):1850-1857.,三种不同的检测试剂，评估不同三个区隔每单位细胞内HPV16型拷贝数随时间的清除情况,乔友林团队载量预测风险的研究,结论：HR HPV病毒载量越高，发生宫颈癌及高度病变的风险越高，提高病毒载量界值可以进一步分流HPV阳性人群，从而更合理的分配卫生资源。,Kang L, Zhao F, Chen F, et al. Value of high risk human papillomavirus viral load in predicting cervical le
18、sions and triaging for high risk (HR)-HPV-positive women.J. Zhonghua zhong liu za zhi Chinese journal of oncology, 2014, 36(4):316-20.,内容,HPV检测技术的诞生背景HPV检测临床应用的进展HPV检测主要的技术及进展硕世21HPV分型定量检测的优势,国内主要HPV检测产品,非核酸信号放大法,digene HC2 HPV检测：检测13种高危型，不分型,德国凯杰,careHPV检测：检测14种高危型，不分型,DH2 ：检测14种高危型，不分型 DH3 ：检测16/1
19、8型+12高危型不分型,杂交捕获法,酶切信号放大法,Cervista HR ：检测14种高危型，分组但不分型 Cervista 16/18 ：检测16&18分型,DNA裂解成为单链,HC2全长8000碱基对的RNA探针与DNA杂交,一抗捕获固定DNA:RNA杂交体,酶催化底物化学发光，基因信号放大仪器检测发光信号,HC2（Hybrid Capture 2）杂交捕获二代技术,携带碱性磷酸酶的二抗与固定的杂交体结合,利用基因杂交、化学发光、信号放大的原理，13种高危型HPV（不分型，半定量）,核酸信号放大法,Aptima HR &Aptima 16、18/45,15高危分型,15高危不分型,16/
20、18分型+13不分型,凯普的21HPV分型检测（PCR+膜杂交法，定性检测）,cobas x 480全自动核酸分离纯化仪,cobas z 480聚合酶链反应仪,日常维护2-7分钟（手工）,样本制备62-149分钟,转换到z4802-3分钟（手工）,DNA扩增和检测86-120分钟,卸载z480中的反应板1分钟（手工）,样品加载到x48011-27分钟（手工）,检测96样本约需5小时，其中手工用时需约40分钟,基于LightCycle480实时荧光PCR技术四个荧光信号检测通道，分别检测：内质控（Intern control）、HPV16型、HPV18型和12高危型HPV,采用磁珠分离技术分离核
21、酸原始收集管可直接上样，但样本加载需要人工操作，特别是加载液基细胞学样本时需要手工开盖所用耗材（枪头、微孔板等）必须额外购买cobas4800专用耗材,cobas4800 检测原理及流程,cobas HPV检测,1次检测可在4个通道内分别报告HPV16型，HPV18型，其他12种高危混合型及内质控-globin的结果,Wright TC Jr, et al. Am J Obstet Gynecol 2012; 206:46.e1-.e11,1、磁珠提取mRNA,2、TMA，转录介导的扩增,3、杂交保护及化学发光检测（DKA）,T(胸腺嘧啶）构成的核苷酸链固定于磁珠上,寡核苷酸序列捕获目标RNA
22、,APTIMA HPV检测（TMA技术，定性检测）,精准医学：HPV检测的应用进展,杂交捕获技术检测13 种高危HPV不分型半定量,荧光PCR技术检测14种高危HPV16/18分型定性,转录介导扩增 （TMA）检测14种高危HPV16,18/45分型定性,荧光PCR技术检测18种高中危+3种低危型21种HPV分型 &标准化定量,不分型分型 & 定性定量,内容,HPV检测技术的诞生背景HPV检测临床应用的进展HPV检测主要的技术及进展硕世21HPV分型定量检测的优势,硕世21HPV分型定量检测系统简介,采用独有专利的“宫颈脱落细胞取样处理标准化”技术和先进的多重荧光PCR定量技术，可在2.5小时
23、内快速、准确地区分样本中的21种HPV亚型，包括13种高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，5种中危型HPV26、53、66、73、82和3种低危型HPV6、11、81；并同步对21种HPV各亚型进行标准化定量。,创新与突破1：分管分型,定量参考基因检测,分管区分21种HPV基因亚型,中国医科大学附属盛京院研究数据,硕世HPV检测与型别鉴定的金标准测序法比较，准确性99.6%,硕世HPV检测（BMRT）的筛查性能：北京大学深圳医院临床研究数据,Chen Q, Du H, Zhang R, et al. Genetics and molecul
24、ar research: GMR, 2016, 15(2).,自采样的检测，硕世21HPV分型定量检测（BMRT）敏感性高于cobas HPV检测,全面检测CFDA要求检测的18种高危型,2015年CFDA颁布最新HPV试剂指导原则,http:/,原文：依据WHO国际癌症研究机构（IARC）及其他国际组织的研究成果，本指导原则建议将HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种基因型列为高危型别，26、53、66、73、82等5种基因型列为中等风险型别。,两种方法HPV检测型别的比较,硕世21HPV分型定量检测18高中危型与CFDA最新要求完全一致,
25、准确区分中国人群常见致病型别,*全球HPV信息中心（ICO）最新发布，链接网址：http:/,WHO/ICO HPV相关统计: 宫颈癌前病变排名前10位HPV型别的分布*,北京大学深圳医院临床数据,研究检出频率位于前四位的亚型是HPV 16、52、58、33,*研究选用的HPV检测方法为：硕世21HPV分型定量检测,Prof. Wu s Data,准确分型，风险分层,2%,0%,癌前病变风险,阴道镜阈值,10%,30%,Nicolas Wentzensen， 2015,创新与突破2：标准化定量,宫颈脱落细胞,HPV病毒,专利号：ZL 201110087602.1,硕世21HPV分型定量检测是首
26、个、唯一采用标准化定量的HPV分型检测,中国医科大学附属盛京院研究数据,313例HPV16阳性病例，随着病变等级提高载量也相应增加,Sun Z et al. Bmc Cancer, 2015.,北京大学深圳医院临床验证数据,硕世21HPV分型定量检测：不同程度宫颈病变病灶中HPV亚型病毒载量,HPV 16,HPV 52,HPV 58,Prof. Wu s Data,北京大学深圳医院临床验证数据,硕世21HPV分型定量检测：不同程度病变病灶组织中病毒载量,Prof. Wu s Data,硕世21HPV分型定量报告单,HPV风险分层列表,HPV阳性亚型,每10000个细胞数量中的病毒载量，对应显示为：6.82107拷贝/1万细胞,HPV亚型病毒载量的百分比,小结,HPV检测在宫颈癌筛查中发挥了越来越重要的作用25岁及以上女性的HPV检测初筛已纳入筛查指南；中国人群宫颈癌前病变最常见HPV型别为HPV16、52、58、33型；硕世21HPV分型定量检测：首个，唯一采用标准化定量的HPV分型检测,
