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1、建立分析方法,色谱分离度与分离性能,HPLC分离的机理,色谱工作者关心的基本问题 - 色谱峰之间的分离度,to,tRA,mAU,time,tRB,R = 分离度tRA = 组分A的保留时间tRB= 组分B的保留时间w = 峰的基线宽度w1/2=半峰宽,分离度值,等梯度洗脱的基本分离度公式,影响分离度的因素,容量因子对分离度的影响,容量因子 - 流动相组成的影响,选择性,影响选择性的参数,有机成分含量低的固定相 有机成分含量高的固定相,色谱柱温度对分离度的影响,柱效,计算柱效,典型的流速值,柱内径 mm(5um 粒度),mL/min,柱外体积的影响,Time, min.,2.1 x 150 mm
2、F = 0.2 mL / min.,所需分离度与柱长匹配,峰对称性,提高分离度,分离度与 k, n 和 的关系,液相色谱流动相及固定相,流动相,与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一起参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。1、 理想的溶剂应有下列特性 1）化学稳定性好，与固定相不互溶、不发生反应2）必须和检测器相适应 使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长 使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别,3）对待测物具一定极性和选择性4）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；尽量避免使用有显著毒性的溶剂5）适宜的粘度 粘
3、度过高，柱压增加 过低（例：戊烷、乙醚等），易产生气泡,2、溶剂的极性 溶剂的极性强弱用溶剂强度参数表示，强度参数值越大，表示溶剂的洗脱能力越大。,3、流动相的选择4、梯度洗脱 特点：可以缩短总的色谱周期，提高分离效能，改善峰形，减少拖尾，可以增加灵敏度，会引起基线漂移,固定相,化学键合固定相方法：通过化学反应将有机分子键合在载体表面形成柱填（约有3/4以上分离问题是在化学键合固定相上进行）特点：稳定、流失小、适于梯度淋洗分离机理：兼有吸附、分配两种分离模式。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。,载体主要是硅胶（表面有硅醇基）,特点为： 可以制备成粒度
4、分布窄的多种粒度 机械强度好，可以填充成稳定、高效的填充床 长期高压操作下不变形 反压较低、柱寿命长 较其它材料制成的柱有更高的柱效 适用于小分子、大分子的分析和制备 高pH值下会分解（pH8）,键合方法： （l）硅酯化（Si-O-R）键合固定相 （2)硅氮型（=Si-N=）共价键合固定相 （3）硅烷化（ Si-O-Si-R）键合固定相使用键合固定相应注意的问题 硅胶键合相的稳定性 键合相色谱分离的重现性 键合相色谱分离的选择性 键合相色谱柱的再生,化学键合相色谱法,正相色谱和反相色谱,反相色谱的定义：在非极性的固定相上，用极性较大的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：反相色谱中键合固定相
5、的极性要小于流动相的极性正相色谱的定义：在极性的固定相上，用极性较小的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：正相色谱中键合固定相的极性要大于流动相的极性,正相色谱和反相色谱,正相色谱和反相色谱的差别：,正相键合相色谱法,固定相：正相色谱中采用极性键合固定相，是把全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活化处理制成表面含有大量硅羟基的载体后，再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化试剂反应，生成表面具有胺基、腈基、醚基的极性固定相。,流动相： 在非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），分离极性化合物。此时，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。
6、主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。,反相键合相色谱法,采用非极性键合固定相,是把全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体,经酸活化处理后,和含有烷基链或苯基的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基(或苯基)的非极性固定相，如C18、C8,流动相： 流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙腈、水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等 具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点,硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影
7、响,分析方法建立,分析时要了解的情况,想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA-仪器制造商的文献充分了解自己的样品对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法,分析时要了解的情况（续1）,灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用?,分离(制备)时要了解的情况,要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?,什
8、么化合物参数能用于分离 ?,分子量不同/MW 2000 凝胶渗透 / 凝胶过滤离子化分子 离子对/ 离子交换 极性不同 吸附/ 反相色谱 同系物 / 苯系物 反相 中性、酸和碱的混合物反相 生物分子 亲和/HIC/凝胶过滤/反相 立体异构体 吸附 手性化合物 手性色谱,结构数据,数据收集,一般的具体步骤,先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节k 值改变保留值调节值改变选择性调节柱长度改变柱效及分离速度,记住,每次改变一个参数,使用文献方法注意点,色谱柱填料的种类、品牌是否相同?注意文献方法的流动相是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色
9、谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量注意梯度条件了解系统的滞后体积（梯度）,色谱方法转换,如果没有与文献或要求相近的色谱柱转换进样量转换流速,常规样品分离的系统方法,总的指导原则,改变可以明显改善选择性的条件避免会影响方法普适性的实际问题减少必要的实验次数，尽可能地利用计算机模拟选择适用于各种常规试样的实验，以便采用同样的方法建立未知样品（离子的或中性）的HPLC分析方法先做简单易行的 实验（改变色谱柱、改变pH、使用复杂的混合溶剂等属于比较难做的条件）,反相HPLC分离的总体方案设计,1、确定样品是属于常规的还是特殊的 特殊样品包括： 无机离子 对映体 生物分子 合成的高分子 碳水化合
10、物 异构体,2、选择分离条件，进行第一次分离,选择流动相在反相色谱中常用水/乙腈pH的选择思路 选低pH可以使柱硅羟基质子化并降低其色谱活性 低pH与常见酸碱官能团的pKa值相差较远，组分在此条件下的tR受pH变化影响小 初期应避免使用三乙胺和离子对试剂等添加剂,准备标准样品 过滤样品 安装色谱柱 冲洗柱，平衡 平衡检测器 进样 分析结果,选择逐步方法开发步骤用强洗脱液开始等梯度洗脱，此后每次运行降低洗脱液强度尝试运行梯度,无峰/响应,分离度差的峰,第一次运行得到的结果可能:,检测方法不正确 浓度太稀,提高进样浓度，或者在无色谱柱的条件下注射少量样品,改变流动相,优化系统,得到了色谱峰 - 是
11、 - 否,检查 HPLC系统,3、做初次运行并根据谱图将样品分类 0.5k20 等度洗脱可行，超出此范围,等度洗脱可行的样品,建议用梯度洗脱的样品,反相保留太弱的样品改变pH、加入离子对试剂、改变柱子、改用正相色谱,强保留样品用非水反相或正相条件,复杂样品,4、对等度方法，用初始梯度运行来估计第二次等度运行的最佳B%5、评价第二次运行中峰的质量-柱效、峰宽、峰形 峰太宽或不对称：要改变初始的分离条件（柱子、pH、添加剂等） 运行情况良好：平行实验，保证柱平衡和可重复的保留时间,6、 对等度方法，可以改变ACN%来改善峰间距和分离度 若有必要， ACN改为MeOH，并根据峰间距和分离度优化MeO
12、H% 可以进一步混合ACN和MeOH成为三元溶剂系统，并优化7、若6方法中分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件,8、对梯度方法，用改变梯度变化速度和柱温来优化峰间距和分离度结果满意，可以按等度分离方法优化溶剂类型分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件9、对梯度方法，改变初始和最后的B%、梯度变化速度、梯度形状可以改善分离度或缩短运行时间10、对等度或梯度方法，改变一个柱条件（柱长、流速、填料尺寸）可以提高分离度或降低运行时间,等度分离方法,反相色谱的方法开发,开发过程实例色谱条件色谱柱：C18，4.6mm15cm流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50
13、、40/60，由强渐弱 （或走梯度）流速：1ml/min样品： 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben),改变容量因子 K,(改变比例), 对羟基苯甲酸甲酯 对羟基苯甲酸丙酯 对羟基苯甲酸丁酯,通过改变流动相比例改变选择性,改变选择性,通过改变流动相组成改变选择性同样强度的不同溶剂,固定相优化：改变色谱柱,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,1,2,4,5,6,7,8,9,10,3,C-18,C-8,10种巴比妥药物的分离（等梯度）,优化流动相 - 困难的分离,1.从甲醇/水开始，优
14、化溶剂组成以使所有色谱峰在合理的 k 范围流出.2.选择洗脱强度相等的乙腈/水混合流动相进行下一次分析.3.用四氢呋喃/水流动相重复分析4.按比例混合等强度流动相再进行进样分析,三种流动相的比较,洗脱顺序,选择性,离子型化合物的分离方式,使用离子交换柱离子交换法主要用于“强”阴、阳离子使用反相柱通过改变流动相的pH值，使样品成中性加入“对离子”，使样品呈中性,离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的pH值，使样品降低离子化使用硅胶基质C18填料使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的pH在2-8内,如果：一些酸在pH低于2时还保持离
15、子化一些碱在pH高于7时还保持离子化可以有以下的选择离子交换色谱使用聚合物反相柱，在pH高于7时用离子抑制法使用“离子对色谱法”,分离弱离子化化合物的初始实验条件,水相缓冲液 /乙腈可变 (k = 0.520),分离变量,初始选择,尺寸粒度键合相,15 (或 25) x 0.46 cm5 或 3.5 mC18 或 C8,溶剂 A 和 B（% B）,温度,体积质量,40C,20 L 25 g,色谱柱,流动相,样品量,流速,1 - 2 mL / min,添加剂,需要时，25 - 50 Mm 三乙胺,缓冲液,25 mM 磷酸钾, pH 3,缓冲液,缓冲液 pKa缓冲范围 缓冲液 pKa 缓冲范围 磷
16、酸 甲酸 3.8 2.84.8 pK1 2.1 1.13.1 乙酸 4.8 3.85.8 pK2 7.2 6.28.2 Tris(三羟甲基氨基甲烷) pK3 12.3 11.313.3 8.3 7.39.3 柠檬酸 硼酸 9.2 8.29.3 pk1 3.1 2.14.1 吡咯 10.5 9.511.5 pK2 4.7 3.75.7 氨 9.2 8.210.2 pK3 5.4 4.46.4,离子对色谱法,在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂与样品中可电离的组份形成“对离子”在反相色谱柱上分离离子型化合物离子对试剂的类型季铵盐、叔胺盐 （正离子），适用于弱酸烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于
17、弱碱烷基长度不同，形成对离子的能力不同,离子对反相HPLC分离阴离子,流动相 A和 B 含有离子对试剂C 和 D 是纯缓冲液,离子对色谱的应用,抗组胺及减充血剂药物的分析,离子对色谱分析水溶性维生素,优化离子对 HPLC,优化参数 流动相的 pH 离子对试剂浓度 离子对试剂选择 流动相组成,方法开发的其他因素,流速对柱效的影响不同内径的色谱柱有自己的最佳流速样品的进样量(浓度)对柱效的影响样品的进样体积对柱效的影响溶剂粘度对柱效的影响以上因素均影响分离度,梯度方法,梯度洗脱的特点,优点单位时间的分离能力增加检测灵敏度提高缺点仪器设备要求高不适合某些检测方式(RI)柱需再生平衡定量分析的重复性较
18、低？,梯度的洗脱方式,复杂样品的一般流出问题,早流出峰的分离度差迟流出峰的峰宽增加而峰高降低.由于k范围宽，所以分析时间长.强保留组分造成柱污染.,等梯度洗脱 - 在洗脱样品的整个过程中，流动相的组成保持不变.,一种解决方案-梯度洗脱,梯度洗脱 - 在分离过程中改变流动相组成.,梯度的其他应用 柱清洗 方法开发中的尝试运行,梯度方法开发- 优化溶剂梯度,流速 柱长 柱重新平衡时间,需要确定的因数: 有机溶剂 初始组成 梯度时间 梯度陡度 梯度形状,选择梯度陡度,陡,平缓,HPLC测定17种氨基酸举例- AQC衍生,流动相A：称取NaAc3H2O 19.04g(或无水NaAc 11.48g)溶解
19、于1000ml纯水中， 用1 ：1的稀磷酸溶液调节PH到约5.2，加1ml EDTA2Na溶液，精确加入三乙胺2.37ml或称取1.72g，边加边搅拌，用稀磷酸调节PH：紫外检测pH4.95；荧光检测PH5.02，用0.45m滤膜过滤，备用。使用之前超声波脱气20分钟流动相B：乙腈/水3：2，再加0.10.25ml丙酮/1000ml,混匀。使用之前超声波脱气20分钟,HPLC测定17种氨基酸举例- AQC衍生,HPLC条件 流动相A ：流动相B 梯度表 step time(min) Flow(ml/min) A% 0 0 1.0 100 1 15 1.0 93 2 20 1.0 85 3 28
20、 0.8 72 4 34 0.7 67 5 39 1.0 0 6 42 1.0 0 7 43 1.0 100 8 53 1.0 100 检测波长：248nm (荧光检测 EX=250nm;EM=395nm) 柱温：37C 进样量：10l,17种标准氨基酸HPLC分析-UV检测,梯度平衡时间的影响（一）,10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复,梯度平衡时间的影响（二）,平衡时间6分钟,平衡时间7分钟,平衡时间8分钟,平衡时间9分钟, 平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足 8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足,梯度陡时, 使用短色谱柱(
21、降低 Vm)常常能改善分离度,4.6 x 50 mm,1.GLY-TYR2.VAL-TYR-VAL3.GLU- 蛋白质AMYLOID FRAGM 1-164.TYR8 血管舒缓激肽5.MET-ENK6.亮氨酸脑菲肽7.血管紧张肽 II8.KINETENSIN9.核糖核酸酶10.INS (EQUINE),4.6 x 150 mm,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,min.,k* = 2.5,k* = 2.6,k* = 4.5,k* = 5.9,0,16,12,8,4,C8, 3.5 m,梯度:2-75% B in 30 min.流动相:A= 5:95, ACN : H2O 0.1% TF
22、AB= 95:5, ACN : H2O 0.085% TFA流速: 1 mL / min.进样: 10 L,每种组分2.6 g温度: 35CUV: 215 nm,仪器对梯度性能的影响,死体积 = 从梯度形成到柱头的体积提高起始浓度将缩短分离时间, 但由于死体积和形成梯度前的等度步骤，将使分离更依赖于仪器泵的滞后体积越小越好.,死体积,定性及定量方法,保留值定性的主要方法 直接与已知标准物对照 某一未知峰和已知标准物的保留值完全相 同可能是 改变色谱柱或流动相，保留时间仍完全相同基本是,定性方法,利用文献的数据进行对比和定性分析 注意HPLC的柱填充技术的复杂性，定性受到限制,最简单的方法：标准
23、添加法 前提：要有标准物 判断的标准：加入标准样后，使未知样色谱峰增高，改变色谱条件，未知峰仍能增高,PDA，光谱图比较、谱库检索 确认色谱峰的纯度 - 保证每个色谱峰下只有一个被测的组份 -检查是否有共流出的物质（杂质）干扰 色谱峰纯度确认的方法 -用光电二极管矩阵检测器比较光谱图 -峰纯度鉴定，四波长比例,MS，质谱图解析、谱库检索,定量分析,定量分析的具体内容确定样品的类型，主要成分/痕量成分使分析条件的分离度（R）大于：1.5色谱峰的定性，峰一致性测定检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围用标样建立标准曲线检查方法的准确度及精确度用标样定期检查方法,（一）定量分析基础,1.定量分析的基本
24、公式 定量分析的目的： 要确定样品中某一组分的准确含量，是一种相对的定量方法 定量分析的方法： 在某些限定条件下，检测器响应值（色谱峰的峰面积或峰高）-所测组分的数量或浓度成正比，,即： 式中： -组分i的质量 组分i的浓度 组分的校正因子（与检测器的性质和被测组分的性质有关） 组分i的峰面积， 组分i的峰高,2.定量校正因子的测定,（1）绝对校正因子（fi) fi的物理意义:单位峰面积所代表的I组分的量是一个与i组分的物理化学性质和检测器的性质有关的常数定量校正 因子的计算公式为： 式中：Ai 、 hi i组分的峰面积、峰高 mi 、Ci - i组分的质量、浓度,（2）相对校正因子（校正因子
25、）：式中：f - 相对校正因子 ，简称为校正因子，无因次量 fi , fsi 物质、基准物质（s）的质量（或浓度) Ai(hi),As(hs)-物质、基准物质的峰面积（或峰高）,质量校正因子(fm) 定义：当物质量用质量来表示时的校正因子称为质量校正因子 (fm),表示单位峰面积所代表的组分质量，质量一般用 g 或 mg 表示. 式中：mi , ms-被测物质、基准物质的质量 Ai , As-被测物质、基准物质的峰面积,（3）校正因子的实验测量方法,样品的准备：测定校正因子时，要精密称定适量 被测组分对照品和基准物质，配制成已知准确浓度的样品。 样品的测定：在已确定的色谱条件下，量取样品进样，
26、从谱图上获得准确的峰面积 计算：根据相对校正因子的计算公式可以算出质量校正因子,（二）定量方法,1.归一化法 定义：把所有出峰的组分含量之和按100%计的定量方法称为归一化法，是一种相对定量方法。 前提：样品中的所有组分都能流出色谱柱，而且在检测器上所有的组分都能产生信号。计算方法： 式中：Ai组分 i 的峰面积 fi组分i的质量校正因子法。,优点：简便、准确缺点：校正因子的测定比较麻烦注意： 主要用于GC的定量测定，当 fi相近时，可直接用峰面积归一化法。 由于检测技术的影响,HPLC中很少使用归一化,2、外标法 是色谱定量分析中比较常用的一种方法，是绝对定量方法。,计算方法：用浓度峰面积（
27、峰高）绘制标准工作曲线，其斜率即为绝对校正因子,要求：回归线性方程 计算相关系数,用单点进行计算： 依据：色谱的定量基础,特点： 简便、快速、适合于大量样品的分析无需各组份都被检出、洗脱需要标样标样及样品测定的条件要一致进样体积要准确 对样品前处理过程中待测组分的变化无法补偿。,3.内标法,待测组分(i)的含量mi为：式中：Ai(hi)、As(hs)待测组分i和内标物s的峰面积（峰高） fi、fs待测组分i对照品和内标物s的绝对校正因子 f相对校正因子，由待测组分i的对照品和内标物s测定,实际色谱图,关键：选择合适的内标物,内标物的选择原则：A、内标物必须是原样品中不存在的物质，其性质尽量与待
28、测组分相近(同系物、异构体) B、内标物不能和被测组分起化学反应，要能完全溶于被测样品中；C、内标物的峰尽可能接近待测组分的峰，或位于几个待测组分的中间，但必须和样品中的所有峰完全分离；D、内标物的加入量应和待测组分相近。,内标法的特点：,进样量或色谱条件有微小变化时对定量结果影响不大 可部分补偿待测组分在样品前处理时的损失 若加入几种内标物，还可提高定量分析的精度。 内标物的选择比较困难，同时内标物称量要求准确，操作麻烦。,4.标准加入法,标准加入法 是一种特殊的内标法， 把待测组分的纯物质作为内标物加入到待测样品中 在相同的色谱条件下，测定加入待测组分纯物质前、后待测组分的峰面积（或峰高）
29、 计算出待测组分在样品中的含量。,具体做法：第一步：在确定的色谱条件下，测定样品中待测组分(i)的峰面积或峰高，Ai(hi);第二步：在第一步所用样品中准确加入已知量为mi的待测组分(i)，同样条件下测出峰面积或峰高，Ai(hi)；第三步：根据定量基本公式 mi=fiAi(hi)计算,mi=fiAi(hi) （前） mi+mi=fi Ai(hi) （后） mi原样品中待测组分(i)的量,标准加入法的特点,不需另外的标准物质做内标，仅需有待测组分的纯物质 进样量的准确性影响不大，操作简单 若在样品前处理之前就加入已知准确量的待测组分，则可完全补偿待测组分在前处理过程中的损失 要求加入待测组分前后
30、两次色谱测定的色谱条件完全相同，才能保证两次测定时的校正因子完全相等,（三）影响定量分析结果准确性的因素,1、样品的制备待测组分不能发生任何损失干扰物和待测组分要完全分离，对于低含量的待测组分采用富集方法制备避免组分浓度变化（溶剂挥发），分解、氧化或其他化学反应也会引起浓度变化,要防止外界物质的污染在样品制备时，要进行样品制备的条件实验，研究各种操作条件（溶解、浓缩、萃取、预分离等）对待测组分含量和形态的影响，选择最佳制备条件,2、进样技术,采用标准曲线法作定量分析时，进样的准确性和重复性（进样误差）将直接影响定量分析结果的误差 固定体积定量环（loop）的进样方式精度最好，其准确度取决于进样
31、器的结构 可变体积进样的精度取决于操作者的技术，和注射器的准确度 自动进样方式的精确度及准确度都可达到定量环进样的水平，然而它又保留了可变体积进样的优点,（1）气相色谱中： 气体样品：采用进样阀定体积进样，进样精度优于0.5% 采用医用注射器定体积进样，精度优于5.0% 固体样品：溶解、稀释后注射器定体积进样，精度2.0%（2）液相色谱中： 一般采用六通进样阀进样，进样精度优于0.5%,3、色谱条件的选择,在分离度1.5的条件下，柱效的变化对采用峰面积定量的定量分析结果没有影响，而对使用峰高定量的定量分析结果有影响。,如其他因素不变，如：K，a，流速等，柱效增加峰面积基本不变，而峰高增加,液相
32、色谱流动相的组成变化，如采用梯度洗脱时，固定相、洗脱液和待测组分之间的平衡很难保持一致，洗脱时基线也常出现漂移使峰面积、峰高测量产生误差。,4、检测器特性 检测器工作的稳定性和线性范围直接影响色谱定量分析结果的准确性和重复性。5、分离度 分离度的大小直接影响峰面积和峰高的计算准确度，进而影响色谱定量分析的准确度。,（四）定量分析的误差来源和校正方法,色谱定量分析中的每一步操作过程都会带入误差，最后定量分析结果的误差则是前面每一步误差的总合。1、系统误差（1）样品制备过程中待测组分的损失 溶解是否完全、浓缩和预分离时是否有挥发、萃取和沉淀是否完全等,（2）色谱仪进样分流比、衰减比不正确或线性响应
33、范围窄进样分流比不正确造成进样量误差；衰减比（记录仪）不正确造成峰面积测量误差；线性范围过窄，引起进样量不当，响应值超过线性范围，出现计算误差,（3）由不正确的标准校正曲线和校正因子引起曲线A：因在零浓度时仍有色谱峰，可能有杂质未分开曲线B：在此浓度内，检测器的响应值是非线性的曲线C：可接受的理想状态 曲线D：表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸附，也 可能是样品制备时的损失,（4）测量者不良习惯和偏向引起 由(1)、(2)、(4)产生的系统误差在色谱定量分析中可采用内标法或标准加入法加以校正，由（3）产生的系统误差只能使用已知准确含量的标准样品进行校正。,2、随机误差 色谱定量分析中的随机误差是指那些原因无法查明、大小随机涨落而且不可避免的误差3.过失误差主要是由操作者工作中的马虎和操作的错误引起的。如：称量错误；样品处理时带入的组分损失和污染；读数错误；仪器操作误差；计算错误等。,
