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1、PCR技术常见问题、原因分析及其对策,淮北师范大学生命科学学院朱秀云,内容,PCR技术的简介,什么是PCR?PCR: Polymerase chain reaction，即聚合酶链反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术,PCR技术的简介,PCR技术的发展历史 关于PCR 的文章首次由美国科学Kary Mullis等 人在 Science杂志上发表 1989 Science杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐 热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到 来。12月Science杂志将PCR和它所使用的聚 合酶命名为第一个“年度分子”。199
2、3 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。,PCR技术的简介,PCR原理的简介 PCR的扩增过程模拟体内DNA的天然复制过程，利用一种从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶，及碱基互补配对原则。通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的多次循环,最终使基因扩增形成特异区段的DNA带，实现DNA在体外的特异性扩增。,PCR技术的简介,重复13步2535轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR的常见问题、原因分析及对策,PCR常见问题
3、无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性,PCR的常见问题、原因分析及对策,PCR常见问题之一：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无；,模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,原因,对策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间,PCR的常见问题、原因分析及对策,PCR常见问题之二：非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,PCR的常见
4、问题、原因分析及对策,非特异性扩增,引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多,原因,对策,重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数,PCR的常见问题、原因分析及对策,PCR常见问题之三：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。,M 1 2,PCR的常见问题、原因分析及对策,拖尾,模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多,原因,对策,纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数,PCR
5、的常见问题、原因分析及对策,PCR常见问题之四：假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,提高PCR反应特异性的策略,四种策略：巢式PCR（Nest-PCR）递减PCR（Touch Down PCR）热启动PCR（HotStart PCR）使用PCR增强剂,提高PCR反应特异性的策略,策略之一：巢式PCR（Nest-PCR）,巢式PCR的使用降
6、低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。,提高PCR反应特异性的策略,策略之二：递减PCR（TouchDown PCR）递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析。,提高PCR反应特异性的策略,策略之三：热启动PCR （HotStart PCR）热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度。现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用。热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。,提高PCR反应特异性的策略,策略之四：使用PCR增强剂甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 增强剂浓度要适当 。,
