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1、PCR、载体构建及转化,1.目的基因分离(PCR）2. 载体构建3. 转化,1.目的基因分离(PCR）,There was a time when to amplify DNA, You had to grow tons and tons of tiny cells. Then along came a guy named Dr. Kary Mullis, Said you can amplify in vitro just as well. Just mix your template with a buffer and some primers, Nucleotides and polym
2、erases, too. Denaturing, annealing, and extending. Well its amazing what heating and cooling and heating will do. PCR, when you need to detect mutations. PCR, when you need to recombine. PCR, when you need to find out who the daddy is. PCR, when you need to solve a crime,从前你要扩增DNA， 总有培养大批细胞的重任要你背。 这
3、时有个家伙叫Kary Mullis博士的， 他钻出来说体外合成也一样OK！ 只要把你的模板混上缓冲液，再加些引物，还有核苷酸和聚合酶。变性，退火，和延伸。 加热-冷却-加热 太神奇了！ 当你想要检测突变，来啊做PCR吧！ 当你想要基因重组，来啊做PCR吧！ 当你想知道孩子他爹到底是谁，来啊做PCR吧！ 当你想要侦破大案，来啊做PCR吧！,PCR 之歌,目的基因分离(PCR）,PCR技术的原理,引物设计常用软件：,DNAstar：序列分析Primer5.0：引物设计DNAman：序列比对在线引物设计：http:/bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/,2. 载体
4、构建,T-Vector连接,反应体系：2Ligation Buffer 2.5lInset fraction 1.5lT-easy vector 0.5lT4-ligase 0.5l混匀后置16连接0.5- 小时。,热击转化大肠杆菌,大肠杆菌感受态制备,细菌细胞在一定的生理状态（感受态），或经CaCl2处理，或制备成原生质体的情况下，都可吸收外源，利用这一特性可将重组导入受体细胞中，用质粒作载体的遗传工程一般使用这种方法。 由于E.coli不会自发地产生感受态，因此E.coli的转化一般采用钙转化法。该方法是将E.coli用冷CaCl2(0) 致敏，而后在高温（42 ）下热休克，这样可使外原D
5、NA进入受体细胞。,涂平板（带抗性ampr）,（一）准备工作：1、制好的带选择压得平板，涂布器，ITPG，X-Gal器；枪头，塑料板，酒精灯、记号笔，封口膜等，2、提前打开37培养箱（二）步骤1、把相关用具放入超净台，开紫外灯，10min.2、将ITPG从-20取出溶化。3、到时间后，烧涂布器，4、从4取出平板，置台上。5、取40l X-Gal于平板中央，6、取16l ITPG加入到40l X-Gal上，涂匀上述液体，直到板面发涩为止。7、将热击产物100l加于平板上，涂布均匀。8、涂好的板封口后标记好质粒种类、日期，制作人，倒置于37培养14小时。,蓝白斑筛选：,野生型大肠杆菌产生的-半乳糖
6、苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为-半乳糖苷酶缺陷型菌株，无法作用于X-gal产生蓝色物质。操作中，添加IPTG以激活lacz中的-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色（空载）。当外源DNA与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，这种重组质粒不再表达肽链，不产生活性-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。,挑菌,准备工作:1、提前打开37摇床，开紫外灯杀菌。2、灭菌的带盖的刻度试管，试管架，消毒的黄枪头，镊子，Amp抗性的LB液体培养基。步骤：1、将A
7、mp抗性的LB液体培养基分装入试管，每管4-6ml。2、用黄色的枪头挑白色的单克隆，连带枪头放入试管中。3、盖上试管盖，置摇床中，37，170转摇培过夜（16-18小时）。,质粒DNA提取,采用改良的SDS碱裂解法，结合生物膜选择性吸附DNA旋转离心柱技术快速纯化质粒 DNA。,质粒DNA提取,准备：1、检查试剂是否齐全，够用，-20预冷的无水乙醇2、灭菌的小三角瓶、枪及枪头、计时器、塑料插板、记号笔、吸水纸、盛冰盒3、计算SII的用量（NaOH,SDS） 步骤：1、在超净台内将试管中的菌液移入1.5ml离心管中，2、1000rpm离心1.0min,其间取SI，和RNase A,3、弃上清，留
8、沉淀4、每管加入100l SI和RNase A 0.4l（RNase A浓度为10.0mg/ml）（可提前算好总的SI和RNase A用量，混匀后分装于离心管中）5、充分涡旋均匀，6、计算好SII用量，临时将0.4N NaOH, 2%SDS 等体积混合于灭菌的三角瓶中，7、每管加入混合好的SII 200l，轻轻上下颠倒几次,质粒DNA提取,8、插入冰盒中，静置5min,此时菌液变的清亮粘稠9、每管加入SIII 150l，上下颠倒数次，此时有白色絮状沉淀出现。10、冰浴5min11、13000rpm 5min12、吸上清液于新离心管（约420l）13、加入2倍体积-20预冷的 无水乙醇，上下颠倒
9、，混匀，-20置30min以上。14、13000rpm 5min，可见白色沉淀15、留沉淀，弃上清，加入70%乙醇900l悬浮沉淀16、13000rpm 5min17、弃上清，留沉淀，风干后呈透明无色。18、加入30l MQW，溶解沉淀。,酶切鉴定,准备：1、提前开37水浴，2、检查药品、用具是否齐全3、合理安排时间，一般晚上做，37水浴过夜。4、盛冰盒。实验在冰上进行。步骤：1、反应体系(20l) 10Buffer H 2.0l BSA 0.2lECORI 0.5lMQW 16.3l质粒DNA 1.0l,目的：检测克隆片断大小的准确性,酶切结果检测,测序,取菌液若干个送生物公司测序填写测序单
10、,GateWay 载体构建:,通过去除冗长的亚克隆步骤节省时间同时将您的基因转移到多个表达系统任何系统体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物分析表达,GateWay 载体构建:,完成构建Gateway表达克隆仅需两步：（1）创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。（2）混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆。,GateWay 载体构建:,常用载体：入门载体（BP反应）Pdnor222.1表达载体（LR反应）PMDC32（超量表达）PMDC164（启动子分析）PH7G （RNAi）pEarleyGate （ABRC stock DB-686）（亚细胞定位）pEarleyGate101 （ABRC stock DB3-683） （亚细胞定位）,3. 转化,电击转化农杆菌,准备：感受态农杆菌；预冷的电击杯；LB液体培养基；,细胞融合仪,PCR鉴定 侵染植物,PCR鉴定 侵染植物,噢噢！,GAME IS OVER.,
