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1、实验一 人类外周血染色体标本制备 一、实验目的 初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。 二、实验原理 正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，外周血细胞中是没有分裂相的。1960年发现外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。,三、实验步骤 、采血 （已完成） 、培养（lymphocytes cell
2、culture） （已完成） RPMI1640培养液，370.5恒温中培养72小时。 3、秋水仙素(colchicine)处理 在终止培养前-小时，加入秋水仙素。 （已完成） 4、离心 （centrifugalization ） 以1000rpm离心10分钟，弃上清，留沉淀并用吸管打匀。,、低渗处理（hypotonic treatment） 加毫升预温(37)的0.075M KCl低渗液（hypotonic solution），用吸管打匀使细胞 悬浮于低渗液中，37水浴箱静止2530分钟。,6、预固定（pre-fixation） 低渗后，加新配的固定剂（甲醇冰醋酸= 31 ）毫升，打匀。,7、
3、再离心 1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。,、固定 (fixation) 加入固定液（甲醇冰醋酸 = 31）5ml，将沉淀打匀，固定20分钟。 、再离心 1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。 10、再固定： 加入固定液（甲醇冰醋酸 = 13），固定 20分钟。,11、再离心 1000转/分离心10分钟，弃去上清液，留沉淀。 12、再固定 加入固定液（甲醇冰醋酸 = 11）打匀，固定 20分钟。 13、制片 固定后，1000rpm离心10分钟，留下0.2ml沉淀物，吸取细胞悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在洒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥
4、（dir drying）。,14、染色（ Giemsa staining） Giemsa染液染色分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。 15、镜检（microscopic examination）,四、试剂和药品 1、 培养液的配制 RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠) 80 小牛血清(56水浴灭活30分钟) 20 植物血凝素PHA (主要成分是粘多糖和蛋白质) 4 青霉素终浓度 100单位/毫升 链霉素终浓度 100单位/毫升 用3.5%NaHCO3调pH到7.0-7.2，玻璃滤器抽滤灭菌。在超净工作台，分装到培养瓶中（每瓶含培养基5毫升）。培养基置于-20冰箱保存。使用前从冰箱中取出
5、，温育至37。,2、肝素（heparin）：浓度0.2，200毫克肝素粉末溶于100毫升生理盐水中。高压灭菌，冰箱保存备用。 3、秋水仙素：10微克/毫升，作为有丝分裂的阻止剂，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停止在中期。称10毫克秋水仙素溶于100毫升生理盐水中，配成100微克/毫升的原液，分装小瓶，高压灭菌，-20冰箱保存。临用时取上述原液用生理盐水稀释成10微克/毫升。 4、 0.075MKCl：0.559克氯化钾溶于100毫升双蒸水中。 5、 甲醇 （ methanol ） 二者以不同比例配合使用 6、 冰醋酸 （acetic glacid） 新鲜配制,、吉姆沙染液（Giemsa）
6、 吉姆沙由天青、伊红和甲基蓝组成 先将0.5克吉姆沙粉未干研磨，加33毫升60预热的纯甘油，在研钵中研磨，在60水浴中保温90分钟。冷却后，再加入33毫升甲醇，滤纸过滤，收集在棕色瓶中保存。原液要提前半年配制。原液中按比例加入磷酸缓冲液即可染染色体标本。 1份Giemsa原液 9份磷酸缓冲液 、磷酸缓冲液(pH 6.8) 溶液A：磷酸二氢钾 (KH2PO4.2H2O) 9.078克溶于1000毫升蒸馏水中。溶液B：磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O) 11.876克溶于1000毫升蒸馏水中。 100毫升缓冲液：需溶液50.8毫升，溶液49.2毫升。,五、注意事项 1、采血接种培养时，注意加
7、入适量的肝素。 2、培养基中不含L-谷氨酰胺，则溶解有RPMI1640培养基的液体可先用浓盐酸调pH值等于4，然后高压灭菌（注意121，15磅，灭菌15分钟）。冷却后，再加入L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、PHA、灭活小牛血清和双抗。 3、接种的血样愈新鲜愈好，最好在24小时内培养。如果不能立刻培养，应置于4冰箱，保存时间过久会影响细胞活力。,4、温度和培养液的酸碱度十分重要。人的外周血中淋巴细胞培养最适温度为370.5，温度过高过低都将影响细胞的生长，但细胞对低温比对高温耐受力强；若是中途停电，可相应延长培养时间。培养液的最适pH7.2-7.4。pH偏酸，细胞发育不良，偏碱细胞会出现轻度固缩。 5、
8、PHA的质量和浓度是培养成败的关键问题。PHA如果保存时间太长，效价会降低，应在培养基中多加一些。 6、培养过程中，如发现血样凝集可轻轻震荡，使凝集块散开，继续培养。 7、最好使用水平式离心机，离心速度不易过高，否则沉降在管底的细胞团不易打散；反之，离心速度太低，细胞会丢失。,8、培养失败的可能原因： 培养瓶等器材洗涤不合要求。 配制培养基溶液的二或三蒸水不合要求。 PHA和培养基存放时间过长。 无菌操作不符合要求，发生细菌污染。 9、标本质量不佳的原因： （1）秋水仙素处理不当。 （2）低渗处理不当，低渗时间的掌握与气温有关。 （3）离心速度不合适。 （4）固定不充分：如固定液不新鲜，染色体形象模糊，呈毛刷状，染色体周围有胞浆背景。因此，固定液纯度要高，临用时新鲜配制。,
