第四章酶生物传感器课件.ppt

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1、1,第四章 酶生物传感器 Enzyme Biosensor 一、酶的本质与特征 酶的本质 酶是生物体内产生的、具有催化活性的一类蛋白质。 根据化学组成分为两大类，即单纯蛋白酶与结合蛋白酶。 根据酶的催化反应类型分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、异构酶等。,1第四章 酶生物传感器,2, 酶的基本特征 酶的高效催化性 酶的催化效率通常比一般催化剂高106-1012倍。酶之所以能高效催化，是通过降低反应所需的活化能实现的。,2 酶的基本特征,3, 酶的高度特异性 酶不仅具有一般催化剂加快反应速度的作用，而且具有高度的特异性。 绝对特异性 相对特异性 立体异构特异性,3,4,酶促反应动力学 酶促反应动力

2、学是研究酶反应速度及各种因素对酶反应速度影响的科学。 主要影响因素包括有：底物浓度、酶浓度、 pH值、温度、抑制剂与激活剂等。,4酶促反应动力学,5,酶动力学测定的是初速度，是指酶在反应过程中底物初始浓度被消耗在5%以内的速度。目的是排除酶反应过程中出现的各种干扰因素，以便测得准确的酶反应速度。,5 酶动力学测定的是初速度，是指酶在反应过程中底物初始,6,底物浓度对酶促反应速度的影响,6底物浓度对酶促反应速度的影响,7,酶浓度对酶促反应速度的影响 若底物初始浓度固定时，酶反应速度与酶浓度呈线性关系。,7酶浓度对酶促反应速度的影响,8,温度对酶促反应速度的影响 每一种酶的催化反应都有适宜的温度范

3、围和最适温度。,8温度对酶促反应速度的影响,9,H对酶促反应速度的影响 每一种酶都有适宜的pH值范围和最适pH值。在一定的pH下，酶促反应具有最高的反应速度，此pH称为该酶的最适pH。,9pH对酶促反应速度的影响,10,10,11,抑制剂、激活剂对酶促反应速度的影响 凡能降低酶的活性甚至使酶完全失活的物质称为抑制剂，抑制剂的种类很多，包括药物、抗生素、毒物、抗代谢物以及酶促反应产物等。,11抑制剂、激活剂对酶促反应速度的影响,12,凡能激活酶活性的物质，均称激活剂。某些酶必须有激活剂存在，才能进行酶促反应。激活剂大部分为某些无机离子，也有一些有机分子。,12 凡能激活酶活性的物质，均称激活剂。

4、某些酶必须有激,13,二、酶传感器 酶传感器是应用固定化酶作为敏感元件与各种信号转换器组合而成的生物传感器。 依据信号转换器的类型，酶传感器大致可分为酶电极、酶场效应管传感器、酶热敏电阻传感器、酶压电晶体型、光纤光学型等。,13二、酶传感器,14,传感器的类型,14 传感器的类型,15,4.1 酶电极传感器 Enzyme electrode sensor 酶电极是由固定化酶与电流型电极或电位型电极组合而成的生物传感器。 具有酶的分子识别和选择催化功能，又有电化学电极响应快、操作简便的特点，能快速测定试液中某一给定化合物的浓度，且需很少量的样品。,154.1 酶电极传感器 Enzyme elec

5、tro,16,电流型酶电极 电流型酶电极是将酶促反应产生的物质在电极上发生氧化或还原反应产生的电流作为测量信号，在一定条件下，利用测得的电流信号与被测物活度或浓度的函数关系，来测定样品中某一生物组分的活度或浓度。,16电流型酶电极 电流型酶电极是将酶促反应,17,制作生物传感器最常用的是氧化酶： 底物+O2 产物+H2O2,17制作生物传感器最常用的是氧化酶： 底物+O,18,基础电极可采用氧、过氧化氢电极，还可采用近年开发的介体修饰的炭、铂、钯和金等固体电极或介体修饰电极。,18 基础电极可采用氧、过氧化氢电极，还可采用,19,氧电极：是一个通过测定电解电流来测定溶液中氧含量的电解池。,工作

6、时，在铂阴极和Ag阳极之间施加0.6V的电压。当E=-0.2V时电极开始电解，产生还原电流，其还原反应式为：,19 氧电极：是一个通过测定电解电流来测定溶液中氧含量,使用最多的是封闭式的Clark氧电极,使用最多的是封闭式的Clark氧电极,21,铂电极与Ag电极组合在一起置于参比溶液中，与被测溶液之间用透氧膜隔开。被测溶液中的溶解氧通过膜扩散到电解质溶液薄层，再扩散到铂电极表面进行还原产生电流。,21 铂电极与Ag电极组合在一起置于参比溶液中，,H2O2电极,H2O2电极基本测量电路和电压-电流曲线,H2O2电极H2O2电极基本测量电路和电压-电流曲线,两极间外加一定电压，实际测量时，外加电

7、压控制在电压-电流曲线的平滑部分，即0.7-0.9V，此时输出电流就与浓度成比例。阳极反应阴极反应,两极间外加一定电压，实际测量时，外加电压控制在电压-,24,24,25,1.葡萄糖传感器 葡萄糖传感器是研究最早、开发最成熟并已市场化的生物传感器，即血糖仪。,各种型号的血糖仪产品,251.葡萄糖传感器 葡萄糖传感器是研究最早、开发最,26,（1）早期的葡萄糖传感器 早期的葡萄糖传感器是由葡萄糖氧化酶膜和电化学电极组成的。在电化学电极的透气膜上固定葡萄糖氧化酶。,26（1）早期的葡萄糖传感器 早期的葡萄糖传感器是由,27,当葡萄糖溶液与酶膜接触时，发生如下反应：,27当葡萄糖溶液与酶膜接触时，发

8、生如下反应：,28,故葡萄糖浓度测试方法有三种： 生成的葡萄糖酸 消耗的氧 生成的H2O2,28故葡萄糖浓度测试方法有三种： 生,29,测量葡萄糖酸的葡萄糖传感器： pH电极和离子敏场效应管测定葡萄糖酸的量来计算样品中葡萄糖的含量，最低检测限为10-3 molL，灵敏度较低；,29测量葡萄糖酸的葡萄糖传感器： pH电极,测量氧消耗量的葡萄糖传感器：,30,Clark氧电极用于测定酶促反应中氧的消耗量(电流降低的量)来计算样品中葡萄糖的含量，最低检测限为10-4 molL 。,测量氧消耗量的葡萄糖传感器：30 Clark氧电极用于,31,葡萄糖氧化产生H2O2， H2O2通过选择性透气膜，在Pt

9、电极上氧化，葡萄糖的含量与生成的电流成正比，由此可测出葡萄糖的浓度。 检测H2O2的方法的本底电流小，灵敏度高，其最低检出限为10-8molL。,测量H2O2生成量的葡萄糖传感器：,31 葡萄糖氧化产生H2O2， H2O2通过选择性透气,32,（2）改进的葡萄糖传感器 为消除环境中氧对测定的干扰，用四硫富瓦烯、二茂铁等容易在电极上氧化还原的介体来代替氧的电子传递作用。电子介体是酶氧化还原活性中心与电极表面之间的电子传递中介物，在电流型酶电极中起着关键性作用。 各种电子传递介体的使用，使得电流型酶传感器的响应速度、检测灵敏度和选择性都得到了很大的提高。,32（2）改进的葡萄糖传感器 为消除环,3

10、3,方法：将葡萄糖氧化酶和电子介体同时包埋于聚合物膜中，或直接修饰于电极的表面构成葡萄糖酶传感器。,33 方法：将葡萄糖氧化酶和电子介体同时包埋于,34,在葡萄糖氧化酶（ ）的催化下，葡萄糖被氧化为葡萄糖酸，再由二茂铁离子将还原型葡萄糖氧化酶（ ）氧化为氧化型葡萄糖氧化酶（ ），然后二茂铁在电极上氧化成二茂铁离子，通过二茂铁在电极上产生的氧化电流来实现葡萄糖含量的检测。,34 在葡萄糖氧化酶（ ）的催化下，葡萄,35,介体传感器的特点：仅用较低的电压就能使介体氧化。传感器对氧不敏感，能在缺氧和氧浓度 变化的条件下使用。二茂铁离子与还原GOD之间的电子传递 快，电极响应迅速。,35介体传感器的特

11、点：,36,采用场效应晶体管和微电极做换能器，以缩小传感器的体积； 利用电子技术、改善信号放大和显示方法，使其易于商品化； 改善采样方法，使患者使用方便或更易于临床应用。 最重要的改进是使用化学电子传递中间介体代替作为自然电子受体的氧，使酶催化反应不再受到溶解氧含量的制约。,36 采用场效应晶体管和微电极做换能器，以缩小,37,（3）血糖仪测试片,血糖仪测试片,37（3）血糖仪测试片血糖仪测试片,38,手表式的葡萄糖传感器,38手表式的葡萄糖传感器,第四章酶生物传感器课件,40,手表式无创血糖仪是近年来出现的一种无创、无痛，能连续测定血糖的设备。它通过电化学传感器和电渗透原理来检测皮下组织液中

12、的葡萄糖浓度，无需针刺采血。 手表式血糖仪测定的是组织间液葡萄糖值，因此要略滞后于指血血糖值。,40 手表式无创血糖仪是近年来出现的一种无创、,41,(2)乳酸电极 血液中乳酸的浓度是反映人体体力消耗程度的重要指标。在体育运动训练中乳酸的检验是极为必要，国际上乳酸传感器已经有成熟的商品仪器。,41(2)乳酸电极 血液中乳酸的浓度是反映人体体力消,第四章酶生物传感器课件,43,还可采用介体修饰的方法制备乳酸传感器。 在电极上滴介体四硫富瓦烯(TTF)浆液，晾干后，将乳酸氧化酶固定在该电极表面修饰层上面，即构成乳酸传感器。,43 还可采用介体修饰的方法制备乳酸传感器,44,44,45,在乳酸氧化酶

13、的催化下，乳酸被氧化为丙酮酸，再由四硫富瓦烯离子将还原型乳酸氧化酶氧化为氧化型乳酸氧化酶，然后四硫富瓦烯在电极上氧化成四硫富瓦烯离子，通过四硫富瓦烯在电极上产生的氧化电流来实现乳酸含量的检测。,45 在乳酸氧化酶的催化下，乳酸被氧化为丙酮酸,46,(3)胆固醇电极,胆固醇电极是一种用于临床测定血清胆固醇含量的电流型酶传感器。血液中胆固醇约有23以酯型存在，13以游离型存在。,46(3)胆固醇电极 胆固,自然界中的胆固醇主要存在于动物性食物之中，植物中没有胆固醇。 兽肉的胆固醇含量高于禽肉，肥肉高于瘦肉，贝壳类和软体类高于一般鱼类，蛋黄、鱼子、动物内脏的胆固醇含量非常高。,自然界中的胆固醇主要存

14、在于动物性食物之中，植物中没有,降低胆固醇的食物： 含膳食纤维丰富的食物 VC 与 VE 饮酒可能使血中的高密度脂蛋白升高，加强防治高胆固醇血症的作用。葡萄酒较合适，但必须严格限制摄入量。,降低胆固醇的食物：,49,胆固醇电极是一种用于临床测定血清胆固醇含量的电流型酶传感器。,结合型酶电极,49 胆固醇电极是一种用于临床测定血清胆固醇,50,根据反应过程中消耗的氧，产生的过氧化氢，用相应的电极组成胆固醇传感器测定电流的变化量，在一定条件下，电流变化量与胆固醇浓度呈线性相关。,50 根据反应过程中消耗的氧，产生的过氧化氢，,51,(4）肌酸和肌酸酐电极,51(4）肌酸和肌酸酐电极脱水肌酸肌酸酐,

15、血清肌酸肝含量测定是衡量肾功能的一个很好的基准。 血清肌酸酐浓度不会因食物的种类而受影响，所以做为判断肾脏机能的依据较血清尿素可靠。 血清肌酸酐浓度与肌肉的量有关，因此肌肉多的排放的尿肌酸酐浓度会比肌肉少的多。,血清肌酸肝含量测定是衡量肾功能的一个很,53,53,54,肌酸和肌酸酐微传感器,54 肌酸和肌酸酐微传感器,55,（5）磷酸盐电极,佝偻病,软骨病,55（5）磷酸盐电极佝偻病软骨病,56,56葡萄糖-6-磷酸盐葡萄糖 + 磷酸酸性磷酸酯酶葡萄糖 +,57,（6）淀粉电极,57（6）淀粉电极淀粉葡萄糖淀粉酶葡萄糖 + O2葡萄糖酸,58,（7）乙醇电极,CH3CH2OH, 可用乙醇来制造

16、醋酸、饮料、香精、染料、燃料等。 医疗上也常用体积分数为70-75%的乙醇作消毒剂等。,58（7）乙醇电极CH3CH2OH 可用乙醇来制造醋酸、,酒后驾驶,饮酒驾车：指驾驶员血液中的酒精含量大于或等于20 mg/100 mL小于80 mg/100 mL的驾驶行为。,350 mL(约相称于1小瓶)啤酒或半两白酒(20 mL),酒后驾驶饮酒驾车：指驾驶员血液中的酒精含量大于或等于20 m,醉酒驾车：指驾驶员血液中的酒精含量大于或等于80 mg/100 mL的驾驶行为。,1400 mL(约相称于3瓶500 mL)啤酒或一两半白酒(80mL),醉酒驾车：指驾驶员血液中的酒精含量大于或等于80 mg/1

17、0,NADH + Fe(CN)64-,NAD+ + Fe(CN)63- + H+ + e-,C2H5OH + NAD+CH3CHO + NADH醇脱氢酶,62,（二）电位型酶电极 电位型酶电极是将酶促反应所引起的物质量的变化转变成电位信号输出，电位信号大小与底物浓度的对数值呈线性关系。,62（二）电位型酶电极,电位型酶电极所用的基础电极是对某种离子有选择性或对气体有选择性的电极,离子选择性电极,气敏电极,电位型酶电极所用的基础电极是对离子选择性电极气敏电极,64,64,1773年，伊莱尔罗埃尔（Hilaire Rouelle）发现尿素。 1828年，德国化学家弗里德里希维勒首次使用无机物质氰酸

18、氨（由氯化铵和氯酸银反应制得）与硫酸铵人工合成了尿素。,弗里德里希维勒（Friedrich Wohler）,尿素电极,1773年，伊莱尔罗埃尔（Hilaire,尿素的分子模型,增高：急性或慢性肾小球肾炎、肾功能衰竭、尿路阻塞、尿路肿瘤、高蛋白质饮食等。减低：妊娠后期、蛋白质摄入不足、营养不良等。,尿素的分子模型增高：急性或慢性肾小球肾炎、肾功能衰竭、尿路阻,67,尿素在脲酶作用下发生水解反应可用氨气敏电极、二氧化碳电极等作为基础电极测定尿素的含量。,67,（2）草酸电极,草酸（乙二酸）结构式, 维生素C代谢 甘氨酸代谢 草酰乙酸水解 异柠檬酸降解 食物摄入：菠菜、茶叶,生物体内草酸的来源：,（

19、2）草酸电极草酸（乙二酸）结构式 维生素C代谢生物体内草,草酸,草酸脱羧酶,2CO2 + 甲酸,草酸 草酸脱羧酶2CO2 + 甲酸,（3）腺苷电极, 参与心肌能量代谢 扩张血流量 合成ATP、腺苷酸的重要中间体,（3）腺苷电极 参与心肌能量代谢,腺苷,腺嘌呤脱氨基酶,肌苷,+ NH3,腺苷腺嘌呤脱氨基酶肌苷 + NH3,（4）苯丙氨酸电极, 哺乳动物的必需氨基酸 是甜味剂阿斯巴甜的主要原料,（4）苯丙氨酸电极 哺乳动物的必需氨基酸,苯丙氨酸,苯丙氨酸胺裂解酶,反式肉桂酸盐,+ NH3,苯丙氨酸苯丙氨酸反式肉桂酸盐+ NH3,74,4.2 酶场效应晶体管传感器(ENFET) ENFET将酶膜复合

20、在ISFET的栅极。 测量时，酶的催化作用使待测分子反应生成ISFET能够响应的离子。,744.2 酶场效应晶体管传感器(ENFET),ISFET工作原理,ISFET工作原理,76,敏感膜与溶液界面产生膜电位，该电位叠加在栅压上，引起场效应管漏电流的变化。根据能斯特方程，膜电位的大小与溶液中的离子活度有关，即:,76 敏感膜与溶液界面产生膜电位，该电位叠加在,77,（一）葡萄糖-FET 葡萄糖-FET是由对H+ 敏感的ISFET和固定在其栅极上的葡萄糖氧化酶膜构成的。,77（一）葡萄糖-FET 葡萄糖-,78,酶催化底物反应时，生成葡萄糖酸根、H+ 和过氧化氢，导致酶膜附近pH值变化，且pH的

21、变化量与葡萄糖含量有关。 溶液中H+的浓度变化，离子敏感膜与溶液界面的膜电位发生变化，该电位叠加在栅源电压上，栅源电压的改变与溶液中pH值的变化量成线性关系。,葡萄糖-FET工作原理：,78 酶催化底物反应时，生成葡萄糖酸根、H+ 和过氧化,为提高葡萄糖-FET的工作性能和测量精度，可采用两个pH敏感的场效应管构成差动式结构。,双栅极酶-FET传感器,为提高葡萄糖-FET的工作性能和测量精度，可采用两个pH,80,一个FET的栅极固定葡萄糖氧化酶膜，作为工作FET；另一个FET的栅极上没有酶膜，作为参比FET。将2个FET接到差动放大器上，干扰因素被消除，使输出电压只对葡萄糖响应，因此输出电压

22、的变化能够反应葡萄糖含量的变化。,80 一个FET的栅极固定葡萄糖氧化酶膜，作为工作FE,81,（二）尿素-FET 尿素-FET是由H+-ISFET和脲酶膜组成，其原理是利用pH-FET检测脲酶水解尿素时溶液pH发生的变化。,81（二）尿素-FET 尿素-FET是由H+-, , ,83,尿素传感器也可采用差动结构，使用两个FET，一个是固定有尿素酶的FET ，另一个则是没有固定尿素酶的FET，作为参比FET，利用运算放大器组成反馈电路。 Ag/AgCl电极可使溶液的电位保持一定。,83 尿素传感器也可采用差动结构，使用两个FET，一,84,84,85,测定时由于脲酶催化尿素反应时导致溶液中的p

23、H发生变化，从而导致溶液-界面上的界面电位改变，经差动放大器后，输出电压与待测溶液的尿素浓度有关。,85 测定时由于脲酶催化尿素反应时导致溶液中的pH发生,86,其他应用： 青霉素-FET L-谷氨酸-FET传感器,86其他应用： 青霉素-FET L-谷氨酸,87,4.3 酶热敏电阻传感器 酶热敏电阻传感器是由固定化酶和热敏电阻组合而成。 用酶热敏电阻测定待测物的含量是依据酶促反应产生热量的多少来进行的。通过温度变化推测待测物的含量。,874.3 酶热敏电阻传感器 酶热敏电阻,88,酶热敏电阻的基本构成,88酶热敏电阻的基本构成密接型柱式反应器型,89,酶热敏电阻的测温方式,89酶热敏电阻的测

24、温方式,酶热敏电阻的测量系统,酶热敏电阻的测量系统,91,酶载体的特点： 机械强度高，耐压性好； 固定化效率高； 化学及生物学稳定性高。目前，载体除多孔玻璃以外，还有多糖类凝胶或尼龙制的毛细管等。,91酶载体的特点： 机械强度高，耐压性好； ,92,优点： 容量小、响应快、稳定性好、使用方便、价格便宜。,92优点： 容量小、响应快、稳定性好、使用,93,4.4 光纤光学型酶传感器,高锟,生于1933年，2009年获得诺贝尔物理学奖“光纤之父”,934.4 光纤光学型酶传感器高锟生于1933年，2009,94,光纤传感器组成：,光纤生物敏感膜（探头）光电换能器,94光纤传感器组成：光纤,(c)单

25、束光纤，生物敏感膜与光纤为一体,生物敏感膜,光纤生物传感器信号转换器的三种结构,(c)单束光纤，生物敏感膜与光纤为一体生物敏感膜(a)双束光,光纤光学生物传感系统,光纤光学生物传感系统,1.光纤生物传感器的特点,抗干扰能力强，不受电磁场的干扰； 不用参比电极，可以微型化； 实现远距离的遥测； 响应速度快，灵敏度高。,1.光纤生物传感器的特点,2. 光纤酶传感器的工作原理 待测物质从样品溶液中扩散到生物敏感膜时，在固定化酶的催化下生成一种待检测的物质； 当底物扩散速度与催化产物生成速度达成平衡时，即可得到一个稳定的光信号，依据光信号的大小与底物浓度的函数关系，得到底物的浓度，一般情况下光信号大小

26、与底物浓度成正比。,2. 光纤酶传感器的工作原理,3. 光纤酶传感器的分类,按照换能器能量转换方式的不同，分为化学发光型、光吸收型、荧光猝灭型、指示剂型和生物发光型。,3. 光纤酶传感器的分类 按照换能器能,（1）化学发光型 某些化学反应伴随光子的释放，释放的光子即化学发光的强度与待测物的浓度呈线性关系。 但有些生化反应不能释放光学信号，需要引入中间物，使其转变成能进行光检测的信号。,（1）化学发光型,鲁米诺（luminol）（3-氨基-邻苯甲酰肼），又称发光氨、光敏灵。在碱性条件下能被许多氧化剂（例如H2O2，ClO-等）氧化而发出蓝色的光，是研究最早、最多、应用最广泛的发光试剂。,鲁米诺（

27、luminol）（3-氨基-,谷氨酰胺 谷氨酸+NH3谷氨酸+O2+H2O 酮戊二酸+H2O2+ NH3鲁米诺+ H2O2 氨基邻苯二甲酸+N2+h,谷氨酰胺酶,谷氨酸氧化酶,谷氨酰胺,鲁米诺+ H2O2 氨基邻苯二甲酸+N2+h,第四章酶生物传感器课件,GOD氧化葡萄糖，生成的过氧化氢启动鲁米诺电化学发光，并通过光纤传感器检测发光信号。酶促反应和发光反应同时发生，因此传感器响应非常快。,鲁米诺+ H2O2 氨基邻苯二甲酸+N2+h,GOD氧化葡萄糖，生成的过氧化氢启动鲁米诺电化学发光,（2）光吸收型 如果被测物A不具有光学活性，经酶催化后产生具有特征光吸收的产物P，或是被测物A具有特征光吸收

28、特性而产物P不具备这种性质，便能通过反应前后吸光值的变化来测定底物。,（2）光吸收型,106,对硝基苯酚在404nm波长有最大吸收峰。,106对硝基苯酚在404nm波长有最大吸收峰。,（3）荧光猝灭型 由于荧光物质分子与溶剂分子相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。 使荧光强度下降的物质称为荧光猝灭剂。,（3）荧光猝灭型,麦芽糖光纤传感器： 大肠杆菌细胞膜上分离出麦芽糖结合蛋白，这种蛋白被激发光激发时产生荧光，但与麦芽糖结合后，荧光活性猝灭。,第四章酶生物传感器课件,（4）指示剂型 在pH光极含有一种荧光染料1-羟基-3,6,8-三硫磷酸(HPTS)。在450nm波长的光辐射下，HPTS

29、受激发出515nm的荧光。 HPTS的荧光强度与溶液的pH有关，生物反应引起微环境的pH改变，从而引起HPTS 的荧光强度的改变，达到检测的目的。,（4）指示剂型,第四章酶生物传感器课件,（5）生物发光型 是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。由细胞合成的化学物质，在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。 生物发光主要有ATP依赖型和还原型黄素单核苷酸(FMNH2)依赖型两类。,第四章酶生物传感器课件,112,含有荧光素、荧光素酶，与ATP及氧一起反应，氧与荧光素结合时发生电子转移，同时发生能量的变化释放出荧光光子而发光。,萤火虫,萤火虫现象,ATP依赖型,112含有荧光素、荧光素酶，与ATP及氧一起反应，氧与荧光素,还原型黄素单核苷酸（FMNH2）依赖型 细菌发光 底物在催化循环中会形成还原型核黄素磷酸盐和醛化合物，当遇到荧光素酶和氧时，就会形成一种激发的络合物，发出480-490nm波长的光。,第四章酶生物传感器课件,思考题：1.简述葡萄糖传感器和尿素传感器的构成及测量原理 。（选取1种信号转换器即可）,思考题：,