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1、第一节 免疫标记技术第二节 免疫荧光技术第三节 免疫酶技术第四节 放射免疫技术第五节 免疫胶体金标记技术,第七章 免疫标记技术及分析应用,用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂、胶体金或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。,第一节 免疫标记技术,荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。,免疫标记技术,分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光免疫测定。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位,免疫标记技术,用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应
2、借以提高免疫学诊断的敏感性,荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明（红色荧光）,放射性同位素： 125I、131I,酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶,免疫荧光检测法（IFA）,放射免疫检测法（RIA）,酶免疫检测法（EIA）,免疫标记技术,液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）,免疫荧光技术,第二节,将抗体或抗原标记以荧光素，然后与相应抗原或抗体结合，形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，借助荧光检测仪测定或定位被检抗原或抗体。 当出现荧光时，表明标记抗体存在，相应的抗原也存在。,抗体的荧光素标记,标记原理：利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形
3、成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标记方法: 搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 非特异染色较低。,FITC 异硫氰酸荧光素,常用的荧光素,返回,去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收,荧光抗体的纯化,荧光检测仪,（1）荧光显微镜 （2）荧光分光光度计（3）流式细胞仪（4）荧光偏振光分析仪,荧光显微镜,利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结
4、构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。,荧光显微镜的种类 透射式 落射式,荧光显微镜的构造,流式细胞仪,荧光酶标仪,（1）直接荧光染色法,将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测抗原。优点：简单、快速、特异性高。缺点：敏感性差。,（2）间接荧光染色法,将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特异性抗体。,（3）补体荧光染色法,将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。,优点：可检测所有的抗原抗体系统，具通用性；敏感性高。缺点：操作流程长、干扰因素多、非特异性荧光多，补体易失活、需新鲜制备不方便。,免疫酶技术,Enzyme Immunoassay（E
5、IA）,第三节,就是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。,抗原抗体反应酶催化反应肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计特异、敏感可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在g、甚至ng水平上对其进行定量。,将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。 滴加底物溶液后，底物可在酶作用下催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。,优点：灵敏度高，特异性强；可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于普查；试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素污
6、染；结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展；操作简便，易于掌握和使用，且重复性好；可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。,缺点：标记反应较难掌握，在操作过程中容易引起酶、抗原或抗体的失活。,一、常用的酶及其底物,酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）；无害；稳定，价廉、易得。,常用酶 底物 显色辣根过氧化物酶 邻苯二胺、H2O2 橙黄色 四甲基联苯胺、 H2O2 蓝色碱性磷酸酶 对硝基苯磷酸酯 黄色,二、 标记方法
7、,酶结合物技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原的聚合物。,戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶 改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2-NH-IgG,三、酶标记物的纯化及鉴定,1、纯化游离酶：增加非特异染色游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色葡聚糖凝胶层析法50%饱和硫酸铵沉淀提纯法,2、鉴定免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA酶标记率测定：分光光度法,四、酶标仪（酶联免疫检测仪）,比色测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量的软件，自动洗板、温
8、育、加样450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm,返回,ELISA,酶联免疫吸附试验,ELISA,Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA基本实验过程,包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色,ELISA原理图,固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）,酶标记的抗原或抗体（标记物）,酶作用的底物（显色剂）,酶标记的抗原或抗体（标记物）,固相抗原或抗体,1. 固相载体
9、的性状：聚苯乙烯等固相载体2. 试剂的配制：所有试剂的配制都用双蒸水3. 包被：(1)包被缓冲液：pH 9.6 碳酸盐缓冲液 (2)包被的浓度: 10g/ml(3)包被的时间：4过夜或371-3h (4)包被的量：100l,酶及其底物,DNM-9602G酶标分析仪,DNM-9602 标配酶标分析仪,DNM-9602A酶标分析仪,酶标分析仪测定OD值,1. 直接法2. 间接法3. 夹心法4. 竞争法5. 捕获法,ELISA种类,1.直接 法,direct ELISAfor Ag,direct ELISAfor Ab,返回,2. 间接法,+,+,+,间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记
10、的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。,包被固相载体: 用已知抗原包被固相载体,加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质,加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体,加底物显色,根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定,间接法ELISA过程,3. 夹心法：,+,+,+,双抗体夹心法,双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,获得待分析物的未标定抗体,将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体及杂质,加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点,洗涤并除去未结合的封闭蛋白,加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物
11、,洗涤除去其他未结合的物质,加酶标抗体生成抗体待测抗原酶标记抗体的复合物,彻底洗涤未结合的 酶标抗体,加底物进行酶催化反应,根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定,双抗体夹心法,双抗原夹心法原理,包被体,待测抗体,包被抗原,标记抗原,双夹心法,返回,4. 竞争法,竞争法的原理,固相支持物表面,待测物,包被抗体,标记抗原,此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体 。,用已知特异性抗体包被固相载体,测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合,对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合,分别洗涤除去未结合的成分,加底物显色,分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸
12、光度值之比， 计算标本中待测抗原含量,俘获抗体（二抗）,待测抗体,标记抗原,包被体,5. 捕获法,血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法,包被体,待测抗原,包被连接物,标记抗体,俘获抗体,特点：所有试剂盒均采用同一包被物和包被工艺,（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上
13、的抗原反应结合。洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。,捕获法操作过程,食品中盐酸克伦特罗的测定 食品中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 赭曲霉毒素 ） 食品中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏菌 ）,甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析,ELISA在食品安全检测中的应用,ELISA用于农药残留的检测,河豚毒素,植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素,苯并芘,主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（ FN ）、 甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、 草不绿（ Alachor ）、 西维因（ Carbaryl ）、 多菌灵及克菌丹（ Ca
14、ptan ）等。,农药的检测：,ELISA检测 “非典型肺炎”冠状病毒,ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体,ELISA在疾病诊断中的作用,ELISA法检测幽门螺杆菌抗体,ELISA试剂盒,放射免疫分析,（radio immunoassay，RIA）,第四节,利用放射性同位素标记技术检测抗原的技术灵敏度高，用于检测激素等血清中微量物质,Rosalyn Yalow （美国）,（1977年获诺贝尔生理和医学奖）,“for the development of radioimmunoassays of peptide
15、hormones”,Veterans Administration Hospital Bronx, NY, USA b. 1921,1959年，Yalow和Berson首次应用放射免疫分析法测定胰岛素,与此同时，Ekins利用竞争性蛋白结合分析技术测定甲状腺素获得成功 开创了生物活性物质微量测定技术的新时代，是微量分析方法学上的一个突破。,放射免疫技术,优点： 特异性强，即抗原抗体的特异性反应； 灵敏度高，结果精确，检测范围10-910-12g； 操作流程简单易行，加样程序简单，测量和 数据处理自动化； 样品用量少、一般无需复杂的提纯步骤； 应用范围广泛，尤其是测量小分子半抗原。缺点： 需要昂
16、贵的检测仪器；同位素污染。,结合相,游离相,免疫胶体金标记技术,第五节,胶体金标记技术,以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。 胶体金颗粒表面带有较多电荷，用胶体金颗粒标记抗体，检测组织或细胞标本中的抗原。,胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。 利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合。,吸附在胶体金表面的抗原或抗体能定向将胶体金颗粒运载到组织或细胞内、固相载体上的相应抗
17、体、抗原的位置。由于金颗粒具有高电子密度的特性，这些标记物在抗原抗体反应处聚集达到一定密度时（即金颗粒107个/mm2），出现肉眼可见的粉红色斑点。,胶体金标记技术,胶体金纸条的不同种类,层析法技术优势：简单现场快速,试纸条组成结构,控制线（C线）,与常规诊断方法相比：,应用领域,常用方法： 胶体金斑点渗滤试验 胶体金斑点免疫层析试验,免疫层析法检测原理分类介绍（双抗体夹心）,（以HCG检测为例）,免疫层析法检测原理分类介绍（竞争反应）,（以吗啡检测为例）,Y2 为固相化的吗啡偶联物,相关仪器设备,BIODOT XYZ3050 点膜喷金机,仪器参数仪器尺寸为： 430mmx410mmX360m
18、m平台大小: 450mmX70mm 平台移动速度: 0-330mm/sec X、Y、Z轴移动误差: 50um 定位精度: 10um in 1 axis;25um in 2 axis 喷点方式 BJQ3000: 非接触喷点AJQ3000: 非接触喷点 划线宽度 BJQ3000:0.50mm/line （喷点0.20mm/drop）AJQ3000: 0.5-5mm 最小喷量 BJQ3000:10nl/dropAJQ3000:1ul/cm 划线精密度BJQ3000:1%AJQ3000: 2%,切条机,仪器参数:进料宽度：100 mm进料长度：不限,可连续进料切割切割宽度：1 mm, 宽度连续可调切割
19、宽度设定位数：0.01 mm切割精度：0.1 mm切割速度：230次/分钟, 速度连续可调切条计数：单次工作和总工作分别计数刀片: 日本进口, 耐磨高碳钢材料抗静电装置：建议选配电源：220VAC重量：20KG尺寸：430(L)330(W)260(H) mm,胶体金结果判读方法：,1. 色卡法 将反应好的试纸条T线颜色与制作的色卡比较，看颜色属于那一个档次，则在数据记录时候填写该档次标识。最后做灵敏度比较。2. 图形扫描法 将反应好的试纸条放在扫描仪器内，选择灰度扫描，获得灰度线条图象。然后打开分析软件，将该灰度图象导入，自动分析出灵敏度，本底情况。3. 读条仪法 很多厂家都开发了对应的读条仪，大部分都是采用简单的30万象素数码摄像头做一个拍摄，然后用软件分析。,
