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1、复习上节课上新课任务六 精液稀释,任务六 精液稀释精液稀释的目的 精液稀释是采精及精液品质检查后，向精液中添加的适合精于体外存活并保持受精能力的液体。精液稀释的目的是： 扩大精液量，增加一次采精量的可配母畜数。 通过向精液中添加营养物质和保护剂，可延长精子在体外的存活时间。便于精液保存和运输。,一、精液稀释液的成分及作用,（一）稀释剂 ：稀释剂主要用以扩大精液容量，要求所选用的药液必须与精液具有相同的渗透压。严格地讲，凡向精液中添加的稀释液都具有扩大精液容量的作用，均属稀释剂的范畴，但各种物质添加各有其主要作用，一般用来单纯扩大精液量的物质有等渗的氯化钠、葡萄糖、蔗糖溶液等。 （二）营养剂 ：
2、 主要为精子体外代谢提供养分，补充精子消耗的能量。如糖类、奶类、 卵黄等。,（三）保护剂1、缓冲物质：精子在体外不断进行代谢，随着代谢产物(乳酸和CO2等)的累积，精液的pH逐渐下降，甚至会发生酸中毒，使精子不可逆地失去活力。因此，有必要向精液中添加一定量的缓冲物质，以平衡酸碱度。常用的缓冲剂有柠檬酸钠、酒石酸钾钠、磷酸二氢钾等。近些年，生产单位采用三羟甲基氨基甲烷(Tris)作为缓冲剂，效果较理想。 2、防冷休克物质 在精液保存过程中，常进行降温处理，如温度发生急剧变化，会使精子遭受冷休克而失去活力。发生冷休克的原因使精子内部的缩醛磷脂在低温下冻结凝固，影响精子正常代谢，出现不可逆的变性死亡
3、。因此，在保存的稀释液中加入抗冷物质，使精子免受伤害。常用的抗冷休克物质有卵黄、奶类等。3、防冻保护物质 在精液冷冻保存过程中，精液由液态向固态转化，对精子的危害较大，不使用抗冻剂，冷冻精液就不能成功。一般常用甘油和二甲基亚矾(DMSO)作为抗冻剂。,4、抗菌物质 在采精和精液处理过程中，虽严格遵守操作规程，也难免使精液受到细菌的污染，况且稀释液中含营养物质较丰富，给细菌繁殖提供了较好条件。细菌过度繁殖不但影响精液品质，输精后也会使母畜生殖道感染，造成不孕。常用的抗菌物质有青霉素、链霉素、氨基苯磺胺等。5、非电解质或弱电解质物质： 副性腺中Ca2+、Mg2+ 等强电解质含量较高，刺激精子代谢和
4、运动加快，在自然繁殖中无疑有助于受精，但这些强屯解质又能促进精于早衰、精液保存时间缩短。为此，需向精液中加入非电解质或弱电解质，以降低精液电解质的浓度。常用的非电解质和弱电解质有各种糖类、氨基乙酸等。,（四）、其他添加剂 除上述三种成分以外，另向精液中添加的、起某种特殊作用的微量成分都属其他添加剂的范畴。1、酶类 过氧化氢酶能分解精液中的过氧化氢，提高精子活力；淀粉酶能促进精子获能等。 2、激素类 向精液中添加催产素、前列腺E型等，能促进母畜子宫和输卵管的蠕动，有利于精子运行，提高受胎率。3、维生素类 某些维生素如B1、B2、B12、C、E等具有改进精子活力，提高受胎率的作用。,二、稀释液的种
5、类 1、现用稀释液。等渗液：生理盐水、蔗糖 2、常温保存稀释液。以糖类和弱酸盐为主，pH偏低3、低温保存稀释液。加入卵黄抗休克 4、冷冻保存稀释液。以卵黄、甘油为主体，具有抗冻的特点。,三、稀释液的配制 A、稀释液应现用现配，如配制后确需保存，经消毒、密封后放入冰箱中最多能保存23d。 B、配制稀释液的器具，用前必须洗净并严格消毒，用稀释液冲洗后才能使用。 C、配制稀释液的蒸馏水要新鲜，最好现用现制。 D、所用药品要纯净，一般使用化学纯制剂。药品称量要准确，经溶解、过滤、消毒后方能使用。 E、卵黄要取自新鲜鸡蛋，抽取时尽量不要混入蛋清，待稀释液消毒冷却后加入。 F、奶粉的颗粒比较大，溶解时先用
6、等量蒸馏水调成浆糊状，然后加蒸馏水至需要量，用脱脂棉过滤后放人9095C的水浴中消毒lOmin。,四、稀释倍数与稀释方法,（一）稀释倍数的表示方法（二）精液的稀释倍数的确定 A、精液稀释倍数，应依据母畜每次受精所需的有效精子数、稀释液的种类、受配母畜数量等确定。 B、公牛的精液一般进行1040倍稀释，公猪的精液一般做24倍稀释。,（三）稀释倍数的计算首先要考虑以下几个因素： 猪1、该份精液总量 250ml2、精子密度 2亿/ml3、有效精子数（保存后使用前精子活率） 0.64、每次输入有效精子数 10亿5、每次输精量 20ml该份精液的有效精子数：250ml20.6=300亿则分成的份数： 3
7、00亿/10亿=30份则稀释后总量： 3020=600ml则稀释倍数： 600-250/250=1.4, C、案例：有一头黑白花种公牛一次采得鲜精11 ml，经检查，精子活力为O7，密度是12亿ml。如为母牛输精时要求有效精子数不少于3 000万，输精量为0.25ml，本次采得的精液处理后，能为多少头母牛输精？ 解：l ml原精液中的有效精子数12亿ml 0.7 8.4亿ml。 稀释后的l ml精液中的有效精子数0.3亿0.25ml 1.2亿ml 稀释倍数8.4亿ml 1.2亿ml 7 (倍)。 输精母牛头数11 ml7(倍)0.25 ml308 (头) 答：本次采得的精液能为300余头母牛输
8、精。,现以公牛精液稀释倍数的计算方法举例如下：,（四）精液的稀释方法及注意事项1、精液稀释应在采精后立即进行。 B、采精后把精液迅速置于30的保温瓶中，以防温度的变化。 C、稀释时把精液和稀释液同时放在30的水浴锅中。 D、稀释时把稀释液沿着精液容器的壁慢慢加入精液中，边加入边搅拌。 E、如需高倍稀释，应先做35倍的低倍稀释，然后再高倍，以防稀释打击。,精液稀释后即可进行保存。通过保存，可延长精子在体外的存活时间，便于使用和运输。 现行的精液保存方式有3种，即 1、常温(1525)保存 2、低温(05)保存 3、冷冻(79196 )保存。,液态保存,固态保存,任务七 精液的液态保存, 1、精液
9、常温保存 常温保存的温度在1525之间，温度允许有一定变动，所以又称为变温保存或室温保存。常温保存所需设备简单，特别适合猪的精液。 （1）原理 常温保存是通过增加酸度，降低精液的pH来抑制精子的代谢活动，以减少其能量消耗。酸性在一定范围内是可逆抑制，通常把pH调整到6.35左右。, （2）方法 （1）向稀释液中充入二氧化碳，如伊利尼变温稀释(1VT)。（2）利用精子本身在代谢中产酸，自行调节pH，如康奈尔大学稀释液(CUE)。（3）向稀释液中加入有机酸，如己酸稀释液(CME)。（4）常温保存的稀释液除降低pH使精于代谢减慢外，还依靠给精子补充足够的养分，同时加入抗菌物质以抑制细菌的孳生。（5）
10、有的还在稀释液中加入缓冲物质；有的加入明胶以阻止精子运动。, （3）稀释液稀释液除能降低PH，使精子代谢减慢外，还能给精子补充足够的养分，同时加入抗菌物质抑制细菌生长和繁殖。另外加入明胶缓冲物质，阻碍精子运动。, 2、精液低温保存 （1）原理 低温保存主要是向稀释液中添加抗冷物质，防止精子发生冷休克。在体温状态下，精子的代谢正常，当温度降低时，精子的代谢活动减慢，当温度降至05，精于的代谢较弱，几乎处于休眠状态。此时精子的物质代谢和能量代谢均降到较低水平，废物累积减少，且此温下不利微生物的繁殖，故可达到保存目的。, （2）稀释液 在马、绵羊的精液保存中应用，参见P186表55。, （3）方法
11、精液进行低温保存时，应采取逐步降温的方法，并使用含卵黄的稀释液，以防冷休克。A、首先把稀释后的精液，按着一个输精量(羊1020个输精量)，分装到一个试管中，封口，再包以数层棉花或纱布，最外层用塑料袋扎紧，防止水分渗入。B、把包装好的精液放到05的低温环境中，经12h，精液即降至05。,泡沫盒保存精液, 注意事项： A、在保存过程中，要维持温度的恒定，防止升温。 B、如特殊情况或运输可用广口保温瓶进行，在保温瓶中加78成满的冰块，把包装好的精液放在冰块上盖好，注意定期添加冰块。 C、如无冰源，可采用化学制冷法，在冷水中加入一定量的氯化铵或尿素，可使水温达24。, 3、精液冷冻保存,精液冷冻保存是
12、利用液氮(196)或干冰(79)作冷源，将精液处理后冷冻起来，达到长期保存的目的。精液冷冻保存是人工授精工作的一大进步，由于保存时间的延长，使精液的使用不受地区的限制，从而加快了家畜品种的育成和改良速度。 （1）精液冷冻保存的原理：利用超低温使精液和精子快速冷冻，快速越过形成冰晶的温度范围（0-60 ）、精液或精子中的水分不形成冰晶，而是形成玻璃化。同时在抗冻剂的存在下使精子免受冻伤，在温度上升至体温精液解冻后精子能够保持完整的形态结构、功能和受精能力。,液态固态,结晶态：缓慢降温形成。水分子有序形成冰晶对精子有害：机械和渗透压损伤。玻璃态：快速降温形成。水分子无序形成玻璃样的超微粒结晶，对精
13、子无害。,（0-60 ）（ -15-25）,（ -60-250 ）,玻璃化是可逆的，不稳定的，当缓慢升温时又可能形成冰晶化。,冷冻时细胞的损伤冰晶：在0-60低温区，缓慢降温条件下形成的，降温越慢，冰晶越大，-15-25对精子危害最大。冰晶的形成对精子造成的机械损伤和渗透压损伤是引起精子死亡的主要物理因素 。玻璃化：在-60-250 超低温区，从冰晶化区域内开始，就快速降温，迅速越过冰晶化进入玻璃化阶段，此阶段对精子无害。添加冷冻保护剂（甘油，二甲基亚砜等） 作用：增强精子抗冻能力，并对防止冰晶发生起到重要作用。, （2）精液冷冻技术 牛的精液冷冻已普及，现以牛精液冷冻为例，将精液冷冻制作技术
14、叙述如下：采精及精液品质检查 ：精液冷冻效果与精液品质密切相关。做好采精的准备和操作，争取获得优质的精液。精液稀释 ：根据冻精的种类、分装剂型和稀释倍数的不同，精液的稀释方法也不尽一致， 现生产中多采用一次或两次稀释法：,A、一次稀释法：将含有甘油、卵黄等的稀释液按一定比例加入精液中，适合于低倍稀释。B、两次稀释法：为避免甘油与精子接触时间过长而造成的危害，采用两次稀释法较为合理。首先用不含甘油的稀释液(第一液)对精液进行最后稀释倍数的半倍稀释，然后把该精液连同第二液一起降温至0-5 (全程1h左右)，并在此温下作第二次稀释。降温平衡降温后，把稀释后的精液放置在0-5的环境中停留24h，平衡的
15、目的是使精子有一段适应低温的过程，同时使甘油充分渗入精子内部，达到抗冷冻保护作用。,精液分装,A、颗粒冻精B、细管冻精, 冻结A、颗粒冻精冷冻：在广口液氮桶上安装铜纱网，调至距液氮面13cm，预冷几分钟后，使纱网附近温度达-80 -1000C，将精液均匀地滴压在铜纱网上，2-4min后，待精液颗粒充分冻结、颜色变浅发亮时，用小铲轻轻铲下颗粒冻精，每50-100粒装入纱布袋中，沉入液氮保存。,B、细管冻精：除按上述方法对细管进行熏蒸冷冻外，也可采用液氮浸泡法。把分装好的精液细管平铺于特制的细管架上，放人盛装液氮液氮柜中浸泡，盖好，5min后取出保存。这种方法启动温度低，冷冻效果好。, 冻精解冻A
16、、低温水解冻（05）B、温水解冻（3040）：效果最好C、高温解冻（5070）,牛细管精液,解冻, （3）冻精的保存与运输 目前，冻精保存普遍采用液氮做冷源，以液氮罐为容器贮存和分发冻精。 液氮及其特性 液氮是空气中的氮气经分离、压缩形成的一种无色、无味、无毒的液体，沸点温度为1958。在常温下，液氮沸腾，吸收空气中的水气形成白色烟雾。液氮具有很强的挥发性，当温度升至18 时，其体积可膨胀680倍。此外，液氮又是不活泼的液体，渗透性差，无杀菌能力。基于液氮的上述特性，使用时要注意防止冻伤、喷溅、窒息等，用氮量大时要保持空气通畅，注意保护。, 液氮容器 包括液氮贮运容器和冻精贮存容器，前者为贮藏
17、和运输液氮用，后者为专门保存冻精用(图59)。当前冷冻精液专门使用的液氮罐型号较多，但其结构基本相同。A、罐壁 由内外两层构成，一般由坚硬的合金制成。B、夹层 指内外壳之间的空隙。为增加罐的保温性，抽成真空。真空度为133 X 10-4pa，在夹层中装有活性碳、硅胶及镀铝绦纶薄膜等，以吸收漏入夹层的空气，也增加了罐的绝热性。,C、罐颈 由高热阻材料制成，是连接罐体和罐壁的部分，较为坚固。D、罐塞 由绝热性好的塑料制成，具有固定提筒手柄和防止掖氮过厦挥发的功能。E、提筒 是存放冻精的装置。提筒的手柄由绝热性良好的塑料制成，既能防止温度向液氮传导，又能避免取冻精时冻伤。提筒的底部有多个小孔，以便液
18、氮渗入其中。,1、内外壳体2、内槽3、夹层4、颈管5、罐盖塞6、提筒,液氮罐结构,从液氮罐取冻精,液氮容器使用应注意的问题 液氮容器主要是靠真空和减少导热来维持其冷藏性能。使用时应注意： A、用前仔细检查外观，看是否又碰伤；然后倒入液氮检查其损耗情况。 B、存放于阴凉、干燥、通风良好的室内，严禁靠近热源和室外日晒雨淋。 C、使用过程中尽量避免碰撞、振动，严禁横放、叠放或倒置。 D、存放液氮的容器要用瓶塞盖好，但瓶口不能密闭，以防爆炸。,F、存放精液等要定期补充液氮，确保冻精浸入液氮中。G、取放冻精时，要尽量避免碰撞颈口。 H、液氮罐要定期清洗，以免污染冻精。,复习思考题1、如何检查和评定精子的活力？2、精液稀释液的成分根据其作用和性质，一般分为哪几类？包括哪些药品？精液稀释的意义如何？3、简述精液低温保存和常温保存的原理。,
