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1、1,色谱-质谱联用技术及其应用,福州大学测试中心卢巧梅2011.10.18,2,授课内容,色谱技术质谱技术气相色谱-质谱联用技术液相色谱-质谱联用技术,3,概述,色谱：化合物分离质谱：纯物质结构分析色谱-质谱联用：结合共同优点GC-MS；LC-MS；CE-MS关键点：接口技术,4,色谱法由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。 将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带，因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来含义，但仍被人们沿用至今。,一 色谱技术,5,色谱的原理,定义：色谱是一种
2、把混合物中多组分分离的实验技术。即利用物质的物理化学性质建立的分离分析方法。实质：分离目的：定性或定量分析,从20世纪30年代始,6,固定相和流动相,填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。,7,按分离机理分类,分配色谱：利用在流动相和固定相中分配系数的不同
3、分离；吸附色谱：利用物理吸附性能的差异分离；离子交换色谱：利用离子交换能力的差别分离；空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同分离,在常用的色谱中，常是几种分离机制共同作用的结果。,注意,8,9,色谱法的流出曲线及有关术语,10,色谱峰所能提供的重要信息,1 样品中所含组分的最少个数2 保留值-定性分析3 色谱峰面积（或峰高）-定量分析4 色谱峰的保留值和区域宽度-评价色谱柱的分离效能5 根据相邻色谱峰之间的距离来选择合适的色谱分离条件,11,二 质谱技术,质谱分析法是通过对被测样品离子质荷比（m/z）的测定来进行分析的一种方法。 被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场运动行为的不同
4、，把离子按m/z分开而得到质谱，并得到样品的定性定量结果。,12,2.1 质谱的发展,40年代,同位素测定和无机元素分析,50年代,有机物分析,60年代,气相色谱-质谱联用,80年代,新的质谱技术,接口技术（基质辅助激光解吸电离源，电喷雾电离源，大气压化学电离源）,新质谱仪（液相色谱-质谱联用仪，富立叶变换质谱仪等）,目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、材料、环境、药物、刑侦、生命科学、运动医学等各个领域。,1911年 世界第一台质谱装置（J.J.Thomson）,70年代,计算机技术引入,13,2.2 质谱特点,14,质谱仪是通过对样品电离后产生的具有不同的 m/z 的离子来进行分离分析
5、的。 质谱仪包括进样系统、电离系统、质量分析系统和检测系统。,2.3 质谱仪的基本结构,15,质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用分子泵可获得更高的真空度。,2.3.1 真空系统,二级真空系统！,16,真空系统为早期的维护反馈提供数字化控制,双分子涡轮泵可快速抽真空和进行稳定操作,17,进样系统目的是高效重复地将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低。进样方式：1 直接进样2 仪器联用的进样 （GC、
6、LC、CE）,2.3.2 进样系统,18,离子源的作用是将欲分析样品电离，得到带有样品信息的离子。,2.3.3 离子源,Note： 质谱检测的是离子； 离子源=接口,19,电子轰击电离 Electron Impact Ionization, EI化学离子化 Chemical Ionization, CI场电离，场解吸 Field Ionization FI, Field Desorption FD快原子轰击 Fast Atom Bombardment, FAB基质辅助激光解析电离 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI电喷雾电离 E
7、lectrospray Ionization, ESI大气压化学电离 Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI,离子化方法,20,电子轰击电离 EI,EI源应用最为广泛，它主要用于挥发性样品的电离。 原理：由GC或直接进样杆进入的样品，以气体形式进入离子源，由灯丝发出的电子与样品分子发生碰撞使样品分子电离。 所有的标准质谱图都是在70 eV下做出的。有机物分子可能被打掉一个电子形成分子离子，也可能会发生化学键的断裂形成碎片离子。 由分子离子可以确定化合物分子量，由碎片离子可以得到化合物的结构信息。,21,22,有些化合物稳定性差，用EI方式不
8、易得到分子离子；为了得到分子量可以采用CI电离方式。,特点：最强峰为准分子离子；谱图简单；不适用难挥发试样；,化学电离（CI）,23,化学电离 CI,反应气体可以是甲烷、异丁烷、氨等。 以CH4为例：,CI源工作过程中要引进一种反应气体。气体经过电子轰击，产生离子，再与试样相互碰撞，产生准分子离子。,24,M + CH5+ MH + + CH4,M + C2H5+ MH + + C2H4,M + C2H5+ MH + + C2H6,加合离子与样品分子反应：准分子离子QM +,生成的M+H +和 M-H +比样品分子M多一个H或少一个H，称为准分子离子。化学电离源是一种软电离方式，有些用EI方式
9、得不到分子离子的样品，改用CI后可以得到准分子离子，因而可以求得分子量。,25,场致电离,特点：强电场将分子中拉出一个电子；分子离子峰强；碎片离子峰少；不适合化合物结构鉴定；,不足：要求样品分子处于气态，灵敏度不高，应用逐渐减少。,以场电离Field Ionization（FI）为例,26,快原子轰击（FAB）,氩气在电离室依靠放电产生氩离子，高能氩离子经电荷交换得到高能氩原子流，氩原子打在样品上产生样品离子。电离过程中不必加热气化，因此适合于分析大分子量、难气化、热稳定性差的样品。例如肽类、低聚糖、天然抗生素等。,FAB源主要用于磁式双聚焦质谱仪,FAB是目前广泛使用的软电离技术，得到的质谱
10、不仅有较强的准分子离子峰，而且有较丰富的结构信息。,27,MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。,待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。,MALDI适用于生物大分子，如肽类，核酸类化合物。可得到准分子离子峰，碎片离子和多电荷离子较少.,基质辅助激光解析电离 (MALDI),28,ESI是近年来出现的一种新的电离方式。它主要应用于液相色谱-质谱联用仪。流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；从而雾化、蒸发溶剂、阻止中性溶剂分子进
11、入后端检测。,电喷雾电离（ESI）,29,ESI是一种软电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析极性强的有机化合物。 ESI的最大特点是容易形成多电荷离子。目前采用电喷雾电离，可以测量大分子量的蛋白质。,30,大气压化学电离源(APCI),APCI喷嘴的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+ 和O+ 等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化。,31,32,各种离子源的相对适用性,33, 质量分析器是质谱仪的核心, 质量分析器的作用是将离子源
12、产生的离子按m/z顺序分开并排列。, 不同类型的质量分析器构成不同类型的质谱仪。, 不同类型的质谱仪其功能，应用范围，原理， 实验方法均有所不同。,2.3.4 质量分析器,34,单聚焦磁场分析器,在一定的B、V下，不同m/z 的离子其R不同，由离子源产生的离子，经过分析器后可实现质量分离。,离子进入分析器后，由于磁场的作用，其运动轨道发生偏转改作圆周运动。其运动轨道半径R可由下式表示：,上式中， m -离子质量 Z -离子电荷量 V -离子加速电压 B -磁感应强度,35,单双聚焦质谱仪体积大；色谱-质谱联用仪器的发展及仪器小型化（台式）需要体积小的质量分析器：,四极杆质量分析器飞行时间质量分
13、析器离子阱质量分析器,体积小，操作简单；分辨率中等；,36,四极杆质量分析器,四极杆质谱结构简单，价廉，体积小，易操作，扫描速度快，适合于GC-MS, LC-MS, 但分辨率不高。,37,飞行时间质谱仪（Time of Flight MS, TOF-MS）,TOF-MS的核心部分是一个无场的离子漂移管；,加速后的离子具有相同的动能,m/z小的离子，漂移运动的速度快，最先通过漂移管; m/z大的离子，漂移运动的速度慢，最后通过漂移管。 适合于生物大分子，灵敏度高，扫描速度快，结构简单，分辨率随m/z的增大而降低。,38, FT-MS的核心为分析室，分析室由三对平行的极板构成。磁力线沿z轴方向，离
14、子的回旋运动垂直于z轴，在与x轴方向垂直的两极板上施加激发射频，在与y轴方向垂直的两极板上检测信号。,(Fourier Transform ion cyclotron resonance Mass Spectrometer, FTICR-MS),傅立叶变换离子回旋共振质谱仪,39,离子阱质量分析器,特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器；,40,2.3.5 检测系统,质量分析器分离并加以聚焦的离子束，按m/z的大小依次通过狭缝，到达收集器,经接收放大后被记录。,41,质谱仪的检测主要使用电子倍增器，也有的使用光电倍增管。由倍增器出来的电信号被送入
15、计算机储存，这些信号经计算机处理后可以得到色谱图，质谱图及其它各种信息。,42,2.4 质谱术语,基峰： RI 100,质荷比： m / z , z = 1, z = 2;,m的计算：组成离子的各元素同位素的质子和中子之和。,精确质量: 基于天然丰度最大的同位素的精确原子量 如： 1H 1.007825 、 12C 12.000000、 14N 14.003074 、 16O 15.994915 精确度与质谱计的分辨率有关。,43,横坐标为离子的质荷比，纵坐标为离子相对强度或相对丰度。,质谱图,44,原子,质量,相对丰度,质量,相对丰度,质量,相对丰度,分类,氢,1.0078,100,A,碳,
16、12.0000,100,13.0034,1.1,A+1,氮,14.0031,100,15.0001,0.37,A+1,氧,15.9949,100,17.9992,0.2,A+2,硅,27.9769,100,28.9865,5.1,29.9738,3.4,A+2,磷,30.9738,100,A,硫,31.9720,100,32.9715,0.8,33.9679,4.4,A+2,氯,34.9989,100,36.9659,32.5,A+2,溴,78.9183,100,80.9163,98,A+2,碘,126.9045,100,A,钠 22.9898 100 A,钾 38.9637 100 0.01
17、 40.9618 7.2 A+2,原子定义,45, 分子离子: M+ , M - e M+ ,z=1时， 其m/z等于天然丰度最大的同位素的原子量之和。, 碎片离子：广义上指除分子离子以外的所有离子。, 母离子与子离子：任何一个离子进一步裂解为质荷比较小 的离子，前者是后者的母离子或前体离 子，后者是前者的子离子。,质谱中的离子, 准分子离子： M+H+, M-H -,46, 偶电子离子EE+： 带双电荷的离子，如 B+, D+ , E+, 多电荷离子： 如 z=2的离子，存在于稳定的结构中。, 重排离子：经过重排，断裂一个以上化学键所生成的离子。,47,三 气相色谱-质谱联用技术,气相色谱法
18、是一种分离挥发性有机混合物很好的方法，但它定性能力较差，特别是遇到分析完全未知的欲定性组分，就更困难了。GC/MS仪集气相色谱及质谱的所长，分离、定性一气呵成。目前从事检验、有机物分析的实验室几乎都把GC/MS作为主要的定性确认手段之一。,48,GC-MS联用仪器 hyphenated technology of GC-MS,49,仪器结构,色谱-四极杆质谱仪结构示意图,50,GC-MS得到的信息,总离子色谱图的横坐标是出峰时间, 纵坐标是峰高。图中每个峰表示样品的一个组份,由每个峰可以得到相应化合物的质谱图。峰面积和该组份含量成正比,可用于定量。,总离子色谱图 （TIC）,51,得到质谱图后
19、可以通过计算机检索对未知化合物进行定性。检索结果可以给出几个可能的化合物。并以匹配度大小顺序排列出这些化合物的名称、分子式、分子量和结构式等。使用者可以根据检索结果和其它的信息，对未知物进行定性分析。 目前的GC-MS联用仪有几种数据库。应用最为广泛的有NIST库和Willey库，前者目前有标准化合物谱图13万张，后者有近30万张。此外还有毒品库，农药库等专用谱库。,库检索,52,气/质联用是解决复杂样品全组分定性定量分析的有力工具。在分析检测和研究的领域中起着越来越重要的作用，特别是在有机化合物常规检测工作中几乎成为一种必备的手段。 如石化、化工、食品、环保、药物研究、生产、质控以及进出口许
20、多领域的众多环节中都要用到GC/MS；法庭医学中各类案件的现场采集物分析（呕吐液、血液等）、毒药、毒品检验与鉴定；甚至体育竞技运动中，国际公认用GC/MS对运动员进行兴奋剂检测数据可靠。,气/质联用的应用,53,Excellence through Evolution,四 液相色谱-质谱联用仪,54,安捷伦液相色谱/离子阱质谱系统,在线真空脱气机,二元或四元梯度液相泵,自动进样器,柱温箱,二极管阵列检测器,55,安捷伦1100 系列 LC/MSD: 易懂,易用,图型化的液相和质谱控制及分析软件,56,LC-MS (四极杆)联用仪器结构示意图,57,LC-MS (离子阱)联用仪器结构示意图,58
21、,安捷伦的专利技术交叉直角喷雾接口,提高灵敏度 减少污染 降低毛细管被堵塞 对非挥发性缓冲液的忍耐能力强,59,大气压化学离子源(APCI),电喷雾离子源(ESI),60,大气压光离子化源 (APPI),新的大气压离子化技术使用紫外光代替corona放电方法进行气态化合物离子化采用高输出通量的气体放电管输出紫外光,Capillary,HPLC inlet,Nebulizer,Vaporizer (heater),Drying gas,UV Lamp,61,多环芳烃的液质分析结果,62,哪一种检测模式最好?,不知道要分析的化合物的性质是酸性或碱性要分析的化合物中同时包含酸性和碱性化合物酸性和碱性
22、化合物的浓度不同,63,离子阱的核心,环电极(ring electrode): 781 KHz 0-12,000 Vpp 质谱分析用端 帽（end caps): 0-781 KHz 0-20 V pp 用来做质谱分离，CID，在质谱分析中的非线形共振喷射为了捕集、CID和提高质谱分辨率，阱里的氦气通过碰撞来减弱离子的运动,64,离子阱中碰撞诱导分解 (CID) 的变量,碎裂电压:作用于帽端的电压 (通常 1 V) 增加离子的动能，其频率为分离离子的共振频率碎裂时间: 碎裂电压作用的时间 (通常 20ms)碰撞气: 氦气是碰撞气,65,调节碎裂电压使CID最大,碎裂电压有一个电压范围(例如0.3
23、 3 V)。 在此范围内波动，确保所有的离子在碎裂时间内(例如 20 ms)都经过CID， (注意碎裂较电压波动快，因此离子在碎裂之前不会被喷射出。),碎裂电压,相对强度,电压太高-离子在CID之前喷射出 电压太低-没有足够的动能使离子碎裂,66,离子阱上MSn 能力,什么是 MSn ?该方式是表明多级离子分离和碎裂步骤可产生离子质谱图。n = 分离和碎裂步骤数目，最小是1（最后一步是全扫描).e.g. MS3 意义 1) 一个母离子的分离和碎裂2) 由前级碎裂得到的子离子的分离和碎裂3) 全扫描质谱分析,67,MS3的图解,累积第一级离子分离第一级离子碎裂第二级离子分离第二级离子碎裂第三级质
24、谱分析Mass,A +,A1+ A2+A3+ A4+,A2+,A11+ A21+A31+ A41+,A11+ A21+ A31+ A41+,MS1MS2MS3,68,MS5 范例,69,在高阶MSn 信号水平的损失,假设每一步碎裂产生3个强度相同的离子,70,Agilent 1100 LC/MS TRAP应用范围,在蛋白质及多肽分析中的应用在天然产物分析中的应用在农药合成及农药残留分析中的应用在染料(如偶氮染料)分析中的应用;表面活性剂分析中的应用;在高分子添加剂分析中应用在双酚A,壬基酚及表面活性剂分析中的应用在食品中兽药残留和毒素分析中的应用在食品及饮用水中农药残留检测中的应用天然产物分析
25、或中草药的品质控制化妆品中违禁激素的测定保健食品中违禁药物的检测,71,电喷雾正离子模式, 全扫描,法莫替丁(Famotidine)中的杂质分析,72,苯二氮卓类（Benzodiazepines ）的分析,三唑(Triazolam),安定(Diazepam),12.5 ng/component,73,其中两个峰的质谱图,74,舒喘宁（Salbutamol )降解产物分析,在药物降解中,降解产物可能保留了紫外发光基团,其紫外光谱图类似,所以无法通过紫外来对降解产物进行鉴定,而利用质谱则通过质谱图可以鉴定降解产物,UV Signal and spectra,MS TIC and EICs,75,磺
26、胺药物分析,sulfamethizoleMW 270,sulfadimethoxineMW 310,sulfachloropyridazineMW 284,sulfamethazineMW 278,共流出峰的鉴定,76,胆汁酸及代谢物的分析,BPC,77,脱氧胆酸分析中m/z 391的一级和二级质谱图,78,79,推测的脱氧胆酸代谢机理,80,甲基橙染料降解产物的分析,81,ass spectra of methyl orange degradation products,82,Fragmentation scheme of methyl orange degradation products.,83,色谱（质谱）技术参考书目,84,色谱（质谱）技术参考书目,85,祝大家一帆风顺！,
