第六章石蜡切片技术讲述ppt课件.ppt

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1、石蜡切片技术,切片技术的应用到现在已有一百年多的历史了。最早应用的只是冰冻切片，随着冰冻切片的应用和实践又进一步利用石蜡的硬度，将要检查的组织块浸渍并包埋于这种坚实的介质之中，制成了石蜡切片。后来又利用明胶，火棉胶等物质的韧性来包埋组织，制成了明胶切片和火棉胶切片。,将各种组织制成非薄的切片标本，需要经过一系列比较繁杂的过程，制作切片的主要过程有：（1）取材（2）固定（3）脱水（4）包埋（5）切片（6）染色（7）封固在这七个主要过程中，又包括着若干步骤。,冰冻切片 石蜡切片 火棉胶切片 取 材 固 定 冰 冻 冲 水 脱 水 透 明 乙醚酒精 浸 蜡 胶液渗透 石蜡包埋 火棉胶包埋 冰冻切片

2、切 片 切 片 染 色 染 色 染 色 封 固 封 固 封 固,第一章 组织标本的处理第一节 取 材,取材是制作切片程序中的首要步骤，取材不当，将直接影响病理诊断和科研工作的效果。组织标本的选用非常重要，不能随意的切取组织来制作组织切片，否则病理检验的结果是不会令人满意的。,一、取材工具： 取材刀具必须锋利。切取标本不应该挤压和揉擦，不应使用有钩镊子或血管钳等手术器械镊取标本，以免损害组织造成人为组织变化，给诊断带来困难或导致错诊，漏诊。,二、取材的注意事项：,（一）大体标本应选择病变或可疑病变的组织。必要时选取病变与正常组织交界处。切取标本的原则是求准而不是求量多，所以切取组织宜小不宜大，以

3、不超过20 x15mmx3mm为度，过大过厚会影响对标本的固定，另方面也影响切片的制作。特殊目的者应属例外。,1. 了使组织切片的结构清楚，取材要及时，组织块必须争取时间及时固定，组织的固定以愈新鲜愈好。2. 取材时对大体标本（肉眼标本）绘制图象，进行仔细描述。包括形状、大小，硬度，颜色，病灶（或可疑病变）部位等。对所取的组织应定位编号。3. 切取各组织块时，切勿挤压损伤，对典型或具有教学和科研价值的肉眼标本，不能因取材而对标本造成人为的“病变”。,4. 取下的组织块应尽量防止其弯曲扭转，如胃肠等组织，应先平展于草纸上粘着以后，慢慢地放入固定液中.固定液的量要充足，应为固定组织的10倍。5.

4、组织采取应在正常与病灶交界之处。组织形状最好为方形或长方形状，这样有利于制片。组织厚薄要均匀。,6. 各组织块应包括各脏器的重要结构，如肾脏组织包括皮质部分和髓质部分。在有浆膜的脏器（如胃等）组织块中，要至少有一块带有浆膜。7. 组织内的钙化病灶或骨质，应在充分固定之后进行脱钙。,组织里存有钙盐可妨碍用常规方法制作良好切片。骨组织及钙化病灶，经过固定后，必先将钙盐除去使组织软化，才能进行常规切片。如脱钙不全则切片易撕开或碎裂并损伤切片刀刃。脱去钙盐的过程称为脱钙。,脱钙,骨组织固定24小时后，锯下不超过0.5mm厚的薄骨片，再以10%福尔马林固定后进行脱钙。（未固定的组织在酸性脱钙液中受到的损

5、伤比已固定的组织约大三倍）。骨组织过厚则需延长脱钙时间，长时间浸于强酸影响切片染色效果。在不影响诊断的条件下，应将骨组织周围的软组织全部剥去。如果切片目的在于观察骨髓病变或骨组织肿瘤，最好除去一部分正常的致密的骨组织，以利于脱钙和制片。脱钙前最好先将骨组织进行脱脂。脱钙要彻底，脱水应充分，在脱水过程中，要注意不使其过度硬化。,硝酸脱钙液配方：福尔马林 5ml 硝酸（比重1.41） 7.515ml 蒸馏水 加至100ml,脱钙步骤取材：骨组织固定于10%福尔马林24小时后再锯取厚度约0.5厘米骨片。固定：再以10%福尔马林固定2天。将组织置于脱钙剂中，每日更换新鲜液、直至组织软化为止。流水冲洗2

6、4小时（除酸）。进行常规脱水，透明，浸蜡，切片。,8. 标本上（组织块）附着的软组织如脂肪等，如属非病变成分，则应在不影响病理诊断的原则下，尽量剥去或切除，以利制片。9. 组织块的固定时间不宜过长或过短，不同的固定液，固定时间有所不同，固定后的组织需要用流水冲洗，再进行脱水制片。10. 切取镜检组织块后，可将剩余的组织放入70%洒精中保存，这样有利于日后再取材切片时的细胞染色。,11. 组织应平整12. 多取包膜13. 充分暴露病灶，取材应避免过多的坏死组织或凝血块，如有手术线结等杂物应拔除。,（二）小标本,1. 微量标本和易碎标本，为避免破损或丢失应以纱布包裹，但包裹前纱布必须浸湿，以免标本

7、粘附纱布上。2. 小标本尽量描述标本的数量3. 小标本尽量取尽4. 多量的小标本应尽量完全取材，未取完的，余下的可备用。,5. 粘膜和皮肤组织应于“立埋”6. 严防挤压组织。7. 内窥镜钳取或穿刺取得的小标本，由于体积小，不易识别，可用伊红等染料染上颜色后包于绸布或吸水纸、擦镜纸中，以免包埋过程中丢失。,三、切取的组织块的编号、数量和取材后是否有存留均应记录四、补取情况应记录。,第二节 组织的固定,一、固定的意义概念：固定是指将各种组织浸入防腐剂内，使细胞内的物质为不溶性。固定的作用即是用一种方法将组织尽可能保持在它原来的形态，且能适于某些研究程序凡是需要制作作病理检验标本的各种组织，无论是制

8、作切片标本，还是制作巨体标本，首先必须固定。在制作切片过程中，固定最为重要的步骤，一张优秀的组织学切片是建立在适当而完全的固定基础之上的。固定不良在以后制片的任何阶段皆不能补救。因此制片的优劣首先取决于最初固定适当与否。,重要的是，被固定组织在动物死后或从活体切取后要尽可能立即固定。及时的取材给迅速固定提供了先决条件。如果不迅速固定，造成固定不良，将导致染色不良后果。组织的良好固定，应该是一次性的；某些固定剂还具有助染的作用，可使细胞各部易于着色。固定不良的组织，即使进行补充固定也起不到改善染色的效果。,二、固定的目的和效果固定组织的目的是设法得到接近正常生命状态的细胞结构，有人说“形态学的美

9、是良好固定产物”，这说明固定的特殊重要作用。,1、抑制自溶和腐败： 组织的固定能保持细胞与生活时的形态相似。因为当机体生命活动停止、或局部器官、组织割离机体之后，组织细胞的代谢功能即行丧失，新鲜组织如果不经固定，任意放置，由于细胞内酶对蛋白质的分解，以及细胞的孳生等各种因素的作用，则易因细菌繁殖而致组织腐烂。细胞内的蛋白质分解酶将蛋白质分解为氨基酸后脱离细胞而引起组织的自溶。 2、保存： 细胞经过固定，不但可以防止自溶和细菌性腐败，而且能沉淀或凝固组织内的各种成份和病理代谢产物，如蛋白质，脂及脂蛋白、脂肪、糖类、色素，其它碳水化合物，无机成份，微生物等都可以经过固定而保存下来，并在制片过程中不

10、为其他试剂溶解破坏。,3、硬化：固定剂的硬化作用能使柔软组织（如脑）的质地变硬而易于操作。4、胶质物体的固化：固定能使细胞正常的半液体状（溶胶）变为不能逆转的固体状（凝胶）粘度。5、肉眼鉴别：固定可将各种细胞和组织成分的析光率作不同程度的改变，增强组织的析光指数，这样能使各种染色成份较之未固定时更容易辨认。,6、对染色的影响：某些固定剂尚具有一定的媒染作用而增进染色（如苦味酸对于染色的媒染作用）可使细胞各种部位易于着色，所以组织固定后有利于制片染色和在显微镜下的观察。此外，固定剂有时也会影响染色效果，导致着色效果不理想（如福尔马林对水溶猩红染色的影响）。7、渗透和固定：固定还可以使组织和细胞的

11、各种渗透压不再发生改变，在制片时就能在最大范围内保持组织和细胞的原来形态。,三、固定的方法及注意事项：,为使组织固定充分，应做到固定容器要合适、固定时间要充足，固定液量要足够。合适容器 固定组织时，应选择合适的容器、一般容器的容积是组织的10-15倍以上。标本瓶应选择瓶口较大的为宜，这样便于固定后的标本经小口瓶硬塞进去，这样不仅不利于标本易于取出，还可能造成人为挤压组织而致形态变化，对大件的标本应按巨检常规切片后放于容器固定。,充足时间 组织固定的时间要足够，根据标本体积大小不同，固定时间应有所不同，组织越大越厚，固定时间应越长，反之。一般4-12小时或更长。在温箱内将固定液稍加温，可使固定作

12、用加快而缩短固定时间。足量的固定液 固定组织时，应该使用足量的固定液，多比少好，一般应为组织体积的5-10倍，最少也不应于五倍。标本最好悬浮于固定液之中。如标本块多时，固定时不应重叠。不要先将标本块放入容器后再注入固定液，以免标本贴付于器皿。,标本如不能及时制片，应改换适当的保存液。在配制混合液时，氧化剂不能与还原剂混合，以免引起化学反应，失去固定作用。对于某些需要制作神经染色和酶反应等组织的固定，要求较一般严格，组织的大小，固定的时间，温度的适当都应慎重考虑，尤其是对于酶反应的固定液，一般都要置于冰箱，在低温的条件下进行固定。固定不好，是得不到满意的切片和合乎标准的反应效果的。任何固定液对人

13、体都有损害作用，因此固定液的容器必须密闭，以防挥发损伤器官和眼睛，忌用手与固定剂直接接触，以免损伤皮肤。,四、固定剂的选择理想的固定剂应该具备下列几种性能：1、渗透性强：固定剂必须能迅速渗入组织，这样组织内各种成分才能尽快地被固定在原位置，而不致弥散。2、组织在固定液的作用下，不应发生显著的收缩和膨胀现象3、固定剂应该有利组织切片和染色，这其中含有两种意义； （1）固定剂对固定后的组织应有利于染色剂的染色。例如：重铬酸钾对于类脂质具有一定媒染作用 （2）固定剂能将组织或细胞中某些必须观察的成分予充分固定而保存下来，以便染色。例如：酸可以渗入脂类物质使其固定下来而不至在制片过程中为酒精和二甲苯溶

14、解或较少地溶解 4、固定液应该同时也是一种较好的保存液。对标本的固定应根据组织的制片目的和要求去选择适当的固定剂,五、固定剂的种类 组织制片技术上所使用的固定剂种类繁多，性能各有不同，有的为氧化剂，有的为还原剂；有的呈酸性，有的呈碱性；有的渗透力强，有的渗透力弱；有些易使组织收缩，有些则使组织发生轻微膨胀现象。一般地说，单一固定剂要想使组织固定后达到某种特殊染色要求是比较困难的。因此，在标本固定中常使用两种以上成分（固定剂）的混合固定液。,单一固定剂,甲醛 (HCHO) 甲醛是一种气体，约有40%重量溶于水。这是一种还原剂，颇易挥发，这种饱和溶液称为甲醛溶液；其商品名叫福尔马林。10%福尔马林

15、的组成系 甲醛溶液（福尔马林） 10ml 水 90ml,甲醛是一种使用广泛、简便的固定剂，同时又是一种良好别的标本保存液。经它固定的标本，可适应一些特殊染色。它的渗透性较强，固定均匀，能增加组织的韧性，组织收缩轻微，硬性大于酒精。福尔马林主要是由甲醛的聚合形式构成，然而聚合形式的固定效果低于单体形式构成的10%福尔马林，为阻止在放置一定时间的重聚作用，一般将溶液的PH值调节至中性或偏碱性。甲醛与蛋白质是在分子间的交联上起反应，最终产生一种不溶性产物。它经过络合交联，使蛋白质固定，能较好地保存脂类；对肝糖也有固定作用，但必须及时固定及时处理，以免产生水解。,酒精（C2H5OH）,酒精为常用的有机

16、溶剂，高浓度酒精能凝固白蛋白，球蛋白和核蛋白，对肝糖有固定作用，核蛋白和肝糖经酒精固定成水溶性状态，因此，经酒精固定的标本如果固定后用水洗涤，则核着色欠佳，肝糖也将被水解。作为一种脂溶剂，浓度在50%以上的酒精可溶解脂肪和类酯体，因此，对脂类的证明，高尔基氏体，线粒体等染色不宜使用酒精作固定剂。酒精还可溶解血红蛋白和损害多数其他色素，因此，如果证明组织蛋白的色素时也不宜以酒精作为固定剂,浓酒精有较大的收缩力，被它固定的组织收缩显著，表面发硬，因而酒精较难渗入到组织中去，组织必须用酒精固定时宜先用80%的酒精固定数小时，然后再换95%酒精，这样可以避免组织过度收缩，因此它的穿透力缓慢且与组织长期

17、接触能使之硬化，如需要证明尿酸结晶和保存糖类，则须用100%酒精固定。酒精既有固定作用，又有脱水作用，经酒精固定的标本不需洗涤，可用较高浓度酒精直接进行脱水，也可暂存于70%酒精中。,(3)乙酸(醋酸、冰醋酸) 是具有刺激气味的无色液体，可与水、乙醇以各种比例混溶，用于固定的浓度为0.35。醋酸穿透力强，染色质固定快，一般大小的组织只需固定3060 mi即可，但可使组织膨胀，一般不单独使用，常与乙醇配制成混合固定液，以抵消乙醇所致的组织收缩和硬化。醋酸可抑制细菌和酶的活性，防止自溶。对糖、脂肪、类脂无固定(保存)作用，但可使核蛋白沉淀，细胞核显示清晰，是染色体最佳固定液。用醋酸固定的组织不必水

18、洗，可直接移人50或70乙醇中。,混合固定剂,(1)中性甲醛液 具有渗透力强、组织收缩小、染色效果好的特点。可用作常规固定液或标本保存液，脂肪染色常用此液固定。中性甲醛液还能保存大多数抗原物质，提高免疫组化检测的阳性率，因此，是免疫组化最常用的固定液。固定时间一般为624h。此液中甲醛的浓度为68配方：40甲醛 150200 mL磷酸二氢钠 4 g磷酸氢二钠 13 g蒸馏水 800850 mI,(2)乙醇-醋酸-甲醛液(AAF液) AAF液由对组织渗透速度快的乙醇(alcohol，A)、醋酸(acetic acid，A)和甲醛(formalin，F)三种固定液混合而成，其特点是固定快速，对脂质

19、、糖类、蛋白质等物质有很好的固定作用，避免了三种固定液单独使用引起的组织收缩或膨胀，是一种优良的混合固定液。AAF液兼有固定和脱水的作用，经过AAF液固定后的组织块可直接移入95乙醇进行脱水。 配方： 95或无水乙醇 85 mL 醋酸 5 mL 40甲醛 10 mL,(3)乙醇-甲醛液(AF液) 由 (alcohol，A)和甲醛(formalin，F)混合而成，兼有固定及脱水作用，适用于皮下组织中肥大细胞的固定。固定后的组织块不必经低浓度逐级乙醇脱水，可直接移入95乙醇脱水，也不用水洗，缩短了脱水时间。配方： 95或无水乙醇 90 mL 40甲醛 10 mL,(4)Bouin液 是一种常规用于

20、活检标本固定的良好固定液，适用于大多数组织的固定，尤其适用于结缔组织染色。其特点是渗透力强，组织固定均匀、收缩较小，染色效果好，细胞核着色鲜明。对皮肤及肌腱等较硬的组织具有软化作用。对含脂肪的乳腺组织、淋巴结和脂肪肿瘤标本的固定效果好。固定时间以1224 h为宜。组织块固定后呈黄色，乙醇脱水时即可脱去颜色，无需特殊处理。此固定液偏酸，并有一定毒性，应避免与皮肤接触或吸入，不适用于标本的长期保存。配方： 饱和苦味酸水溶液 75 mL 40甲醛水溶液 25 mI 醋酸 5 mL,(5)Zenke 液适用于一般组织固定，胞核和胞质染色均清晰，对免疫球蛋白染色最好，也可用于病毒包涵体、某些肿瘤标本的固定。含血量较多的标本(如淤血的脾、肺等)不宜使用。一般大小的组织块固定时间为1248 h，加热可缩短时间。固定后流水冲洗组织块12 h。染色前需经脱汞处理。此固定液不能用金属容器盛放，也不能用金属镊子夹取固定后的组织块。配方： 重铬酸钾 2.5 g 氯化汞 5 g 加蒸馏水至 100 mL 醋酸 5 mL(用时加入),常见问题及处理,