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1、Chapter 4 Animal Cell Culture, Biology of cells in culture Fluid for cell culture Standard cell culture techniques Establishing a cell line or cell strain Cell freezing and recovery,Animal Cell Engineering,Section 5：细胞系和细胞株的建立,一、肿瘤细胞的体外培养与建系过程,以人上皮型鼻咽癌CNE-2细胞系的建立为例问题：具体的建系过程应该包括？,1. 取材,用鼻咽活检钳从一鼻咽癌患者
2、的鼻咽部肿物获得组织块。,2. 原代培养,1） 鼻咽部肿物组织放入含青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液内，于4下静置2小时。2） 然后将组织剪切成1-2mm3的小块。用含青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液洗涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中。3） 37、CO2培养箱内培养2小时后，再补加含20%的小牛血清的RPMI 1640培养液，继续培养。,3. 建系过程,组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速迁移和生长，相互连接成片。2周后，可以见到成纤维细胞生长。8周后，上皮细胞生长开始明显加快，并向周围延伸。用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维细胞。这样处理后的细胞在
3、传代三次后，贴壁生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。2周后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长，命名为CNE-2。CNE-2经生物学特性分析后确定细胞系建立成功,克隆细胞株,通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的稳定的、具有特殊性质或标志的培养物。 稳定的特殊标记，如：染色体组型，特殊的染色体标志或特定的同功酶谱。特殊性质，如：一定的生化特性，温度敏感突变株,二、细胞株的建立过程,1. 细胞克隆技术(p59),培育细胞株可采用细胞克隆技术。 一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来，分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法称为克隆化(cloning)。,2. 细胞克隆培养
4、的技术方法, 稀释铺板法 饲养层克隆法 胶原膜板或血纤维蛋白膜板克隆法 琼脂克隆法 毛细管单细胞克隆法,饲养层克隆法,饲养细胞：一层经过特殊处理的用做克隆细胞底物的细胞层。制备过程过程如下：,饲细胞层克隆法,琼脂克隆培养,3. 影响克隆形成率的因素, 接种细胞的密度 培养基、血清 饲养细胞 激素和生长因子 CO2、适应性生长基质,原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂。因此在培养初期，存活和生长的细胞类型也是多种多样的。所以再培养不仅仅是为了维持细胞不断地生长，而且是使培养物逐步成为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，即细胞系(或株)。,三、细胞系（或株）的鉴定,1. 细胞系鉴定指标
5、,当细胞系建立后，应对细胞系进行一系列鉴定后，才能应用于细胞生物学、免疫学、细胞遗传学等方面的研究。鉴定内容应包括:1)细胞系的细胞来源；2)细胞系的纯度，即除了主类细胞外，还杂有哪类细胞；3)细胞系的稳定性，即细胞连续培养过程中主要指标应无明显变化；4)累积细胞系的形态及其表达特征的基本数据，以及其与来源细胞的差异等,2. 细胞系的鉴定方法,1）形态学：活细胞观察；固定染色观察培养细胞。2）染色体： 染色体是一种鉴定细胞系的种属、性别来源较为确切的指标；也是检查细胞系是否趋于稳定，在离体培养条件下细胞有否发生转化的可靠指标；是区别正常细胞与恶性细胞的指标。 采用染色体数目、核型分析以及染色体
6、分带技术检测。,3）同工酶谱： 通常采用G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、LDH(乳酸脱氢酶)、核苷磷酸化酶三种方法，根据条件选择。,4）细胞DNA遗传特征: 限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism RFLP) 是指那些在生物进化过程中，DNA序列发生某些中性突变，突变的结果是失去或获得一个酶切点，因此当基因组DNA用限制性内切酶酶切后，限制性内切酶片断加长或缩短；用同源的克隆DNA为探针可以探测出来。另外也可能在生物进化过程中DNA分子结构发生重排，使DNA碱基排列序列改变，影响内切酶切点,使内切酶酶切片断呈多态性。 一般采用
7、Southern印迹杂交法检测。,细胞转化及恶性程度检查,一般利用软琼脂培养法检测,四、档案资料的建立及其管理, 细胞系（或株）的建立者 组织来源 细胞学性状 培养条件和方法 冻存液等,建立细胞株（系）的要求,组织起源和已经传代的代数冻存液细胞活力培养液：培养基、血清和抗生素融解后细胞生长特性接种存活率,细胞形态核型无菌检测：细菌、真菌等物种检测：检测同工酶谱反转录酶检测细胞建立者检测者,以美国ATCC细胞库的标准，必须有以下的鉴定数据，才能入库。,细胞系或细胞株的命名,HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立；每3天传代，每次接种3105细胞毫升。,
