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1、酶联免疫吸附试验(ELISA)测定方法,ELISA概述ELISA基本原理ELISA试剂的组成ELISA测定方法ELISA实验过程ELISA在食品检测中的应用ELISA在国外研究进展,ELISA概述,enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在食品安全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品中抗生素检测的试剂盒产品。,酶联免疫吸附试验测定法和其他免疫方法一样，都是以抗体和抗原的特异性结合为基础，其差别在于酶联免
2、疫方法以酶或者辅酶作为标记物来标记抗原或抗体，用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应。 其最大的特点是利用聚苯乙烯微量反应板（或球）吸附抗原或者抗体使之固相化，在其中进行免疫反应和酶促反应。,ELISA基本原理,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原抗体的形成）在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与干扰物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离） 加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产
3、物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应）,ELISA基本原理图示,洗涤的方法将固相载体上的复合物与其他物质分离,将抗原或抗体固定于合适的载体上，并保持其生物活性,使抗原或抗体与某种酶连接，形成酶标抗原或抗体,加入酶反应底物，复合物上的酶催化底物使其分解，氧化或还原成有色产物,待测样品与酶标抗原或抗体反应,ELISA试剂组成,完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）（3）酶的底物 （4）系列参考标准品（定量测定）（5）酶标记物及样本的稀释液（6）洗涤液（
4、7）反应终止液,1.固定载体固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为812的96孔式。,2. 免疫吸附剂已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。,3. 酶标记物即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。 酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或
5、少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外酶标记物还要有良好的稳定性。 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP),4. 酶的底物 HRP的底物常用的供氢体有邻苯二胺(OPD)和四甲基联苯胺(TMB) 。OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高。 OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。 先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作
6、为底物应用。,5. 洗涤液洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。,6. 酶反应终止液常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。7.参考标准品定量测定的EL
7、ISA试剂盒应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。,ELISA测定方法,ELISA常用测定方法主要直接法和间接法。直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗原直接作用，加入底物后，显色，其颜色深浅与样本中抗原量成正比；间接法是使已知抗原吸附在固相载体上，与待检测样本中的抗体作用，加入酶底物，显色，颜色深浅与样本中抗体量成正比。,ELISA大致分为三类：（1）测定抗体的间接法。（2）测定抗原的双抗体夹心法。（3）测定抗原的竞争法。 前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法事测定小分子抗原的方法，因而尤
8、其适用于食品分析。,ELIZA 方法图示,间接法,“Indirect” ELISA,The steps of indirect ELISA follows the mechanism below:A buffered solution of the protein antigen to be tested for is added to each well of a microtiter plate, where it is given time to adhere to the plastic through charge interactions. A solution of non-re
9、acting protein, such as bovine serum albumin, or casein is added to block any plastic surface in the well that remains uncoated by the protein antigen. Then the serum is added, which contains a mixture of the serum donors antibodies, of unknown concentration, some of which may bind specifically to t
10、he test antigen that is coating the well. Afterwards, a secondary antibody is added, which will bind any antibody produced by a member of the donors species (for example, an antibody produced in a mouse that will bind any rabbit antibody). This secondary antibody often has an enzyme attached to it,
11、which has no effect on the binding properties of the antibody. A substrate for this enzyme is then added. Often, this substrate changes color upon reaction with the enzyme. The color change shows that secondary antibody has bound to primary antibody, which strongly implies that the donor has had an
12、immune reaction to the test antigen. This can be helpful in a clinical setting, and in R&D. The higher the concentration of the primary antibody that was present in the serum, the stronger the color change. Often a spectrometer is used to give quantitative values for color strength,双抗体夹心法,非竞争结合反应 常用
13、于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇,Sandwich ELISA,A less-common variant of this technique, called sandwich ELISA, is used to detect sample antigen. The steps are as follows: Prepare a surface to which a known quantity of capture antibody is bound. Block any non spec
14、ific binding sites on the surface. Apply the antigen-containing sample to the plate. Wash the plate, so that unbound antigen is removed. Apply enzyme linked primary antibodies as detection antibodies which also bind specifically to the antigen. Wash the plate, so that the unbound antibody-enzyme con
15、jugates are removed. Apply a chemical which is converted by the enzyme into a color or fluorescent or electrochemical signal. Measure the absorbency or fluorescence or electrochemical signal (e.g., current) of the plate wells to determine the presence and quantity of antigen.,A sandwich ELISA. (1) P
16、late is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) enzyme linked capture antibody used as detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.,竞争法,如下图所示.在进行测定时首先将包被了抗
17、体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液和酶标记物；在测定孔中同时加入酶标记物和待检样本（抗原），酶标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物通过洗涤去除，加入底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化还原成为有色的产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标记物结合加入底物后呈色较深，当样本含有抗原时，样本中的抗原和酶标记物共同竞争抗体的结合位点，酶标抗原的比例越高，结合在固相抗体上的酶标抗原就越多，酶标抗原的比例越低，结合在固相上的抗体就越少，而在一定的条件下，复合物上酶的量（也反映
18、了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从而进一步得知样本中抗原的多少。这就是竞争法ELISA的原理。,Competitive ELISA,A third use of ELISA is through competitive binding. The steps for this ELISA are somewhat different than the first two examples:Unlabeled antibody is incubated in the presence of its antig
19、en. These bound antibody/antigen complexes are then added to an antigen coated well. The plate is washed, so that unbound antibody is removed. (The more antigen in the sample, the less antibody will be able to bind to the antigen in the well, hence competition.) The secondary antibody, specific to t
20、he primary antibody is added. This second antibody is coupled to the enzyme. A substrate is added, and remaining enzymes elicit a chromogenic or fluorescent signal.,ELISA实验过程,1. 实验试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。 ELISA实验中应用蒸馏水或去离子水，自配的缓冲液的PH应用pH计进行较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。,2. 加
21、样在ELISA实验中一般有5次加样步聚，即加标准品、加样本、加酶标记物、加底物、加反应终止液。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加样时一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。,3. 保温 在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一次抗原抗体反应。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。加入板孔中的标本，其中的抗原并不是
22、都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。,温育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）等。 为了便于操作目前绝大部分的试剂盒均采用室温进行温育反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。,4. 洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但
23、却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。 聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。,洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作主要为浸泡式，过程如下： a.吸干或甩干孔内反应液； b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）； c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放1
24、-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短； d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干； e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。,5. 显色和比色5.1 显色显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。底物显色一般在室外温或37反应20-30分钟后即不再加深，约40分钟将达到显色的顶峰，再延长反应时间，可使本底值增高。底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，
25、显色反应结束时加入终止液终止反应。产物用各类酸性终止液终止后会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。,5.2 比色比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如TMB的吸收波长为450nm，表示方法为A450nm或OD450nm。,酶联免疫技术（ELISA）比传统的检测技术具有灵敏度高、特异性好、快速、方法操作简单、样品处理量大、使用范围宽、检测费用低、易商
26、品化等优点。因此可以肯定，酶联免疫在食品领域必将得到广泛的应用。,ELISA在食品检测中的应用,（1）检测食品中的毒素 目前发现能引起人中毒的霉菌代谢产物至少有150种以上，常见的产毒性真菌有曲霉菌属、青霉菌属、镰刀菌属等，其中最常见且研究最多的是黄曲霉毒素、超曲霉毒素等。例如有报道利用酶联免疫法测定酱油中黄曲霉毒素B1(AFTB1)。过去酱油的AFTB1测定多采用限量法，指标仅限于5g/kg。 有学者做了检测证明，利用酶联免疫测定法测定，最低检出限为0.1ng/ml，如果采用样品稀释法排除干扰，稀释50倍可排除共存物的干扰，按稀释50倍算，最小检出物浓度为50ng/ml。,（2）检测食品中的
27、残留农药 在美国已将其作为饮用水的检测指标之一，规定最大残留量为0.04mg/l。用酶联免疫试剂盒检测克百威，已有报道最低检测限为0.01mg/l，线性检测范围为0.0110mg/l，回收率高于90%。用酶联免疫法检测杀虫剂克百威残留较常规的仪器分析具有操作简便、灵敏度高、特异性强等的优点。,（3）检测食品中的微生物 目前，传统的微生物检测方法仍然是食品中的常用方法，但是存在操作繁琐、时间长、工作量大等缺点，对大部分微生物来说，用传统的检测方法至少要45d，有些致病的微生物甚至无法进行人工培养。 各类肉品易受多种致病微生物的污染。其中沙门氏菌使人畜共患肠道病原菌和细菌性食物中毒重要的病原菌。原
28、有的常规检测方法，存在操作复杂、需要特殊的仪器、检测时间长等弊端。因而开始有学者开始利用酶联免疫吸附检测法检测沙门氏菌。该方法比常规的培养法提前34d，不需要特殊的实验设备，肉眼即可观察结果，且样品易保存。,（4）检测食品中的其它成分 免疫球蛋白指具有抗体活性、能与相应的抗原发生特异性结合的球蛋白，是构成体液免疫的重要物质。牛乳中特别是初乳中免疫球蛋白的含量特别高，最近开发的免疫乳，就是通过对乳牛进行免疫注射从而提高牛乳中免疫球蛋白的含量。因免疫球蛋白也是一种蛋白质，具有蛋白质的共性，但其在上述制品中的含量又相对较少，常规的蛋白质的测定方法无法测出免疫球蛋白的含量。用酶联免疫法即可成功解决这个
29、问题，且同时完成含量与活性的检测。,ELISA在国外研究进展,Shearera.L.通过实验证实了ELISA应用于BFDV（一种导致鹦鹉的嘴和羽毛病变的病毒）的检测中与先前一直应用的HI试验相比，试验过程（对于样品的处理等）大为简化，而且ELISA试验结果更加准确。,2008 Sacha Stelzer-Braid 在这篇文章中，通过试验发现ELISA可以进行抗H5抗体快速检测以适应临床需要。但同时发现ELISA在进行H5抗体检测的过程中会受到H3N2和H1N1的联合作用而呈现出假阳性。,由于肉类产品在加工过程中掺假行为时有发生，同时考虑到以下三个方面的原因：首先肉类掺假会使经济波动，其次某些
30、消费者有可能会发生变态反应，第三宗教的原因。从以上三点出发，我们就应该考虑到一种方法，来鉴定肉的真实性或是可靠性。由于ELISA的快速专一等优点，很快使其在这一领域大显身手。 有学者就对熟肉制品的来源进行了ELISA的分析(Ayaz, Y., Ayaz, N. D., & Erol, I. (2006). Detection in meat and meat products using enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Muscle Foods, 17, 214.),同样在鱼类食品深加工的过程中，也存在外形被破坏后无法进行种类识别的问
31、题。而这种问题的存在往往导致一定的商业欺骗，如将一些不值钱的小鱼混充值钱的鱼类做成罐头。因此进行这一方面的研究也是有必要的，而Rehbein等人通过研究证实了ELISA再鱼种类的检测上与PCR技术比起来要简单而且有效，更适合于大规模的生产应用。【Rehbein, H., Sotelo, C. G., Pe rez-Mart n, R. I., Chapela-Garrido, M. J.,Hold, G. L., Russell, V. J., et al. (2002). Dierentiation of raw orprocessed eel by PCR-based techniques
32、: Restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP) and single strand conformation polymorphism analysis (SSCP). European Food Research and Technol-ogy, 214, 171177.】,在牛奶制备奶酪的过程中掺假的行为会导致诸如变态反应、宗教、道德等方面的问题。比如在以羊奶为原料的高级奶酪的制备过程中，常常有人会用一些山羊奶加上牛奶来冒充原料。而利用ELISA方法的可靠性和敏感性就可以检测出那些造假的奶酪。Hurley等人就通过ELI
33、SA的方法在一些未注明含有牛奶的羊奶和水牛奶中将其检测出来。 【Hurley, I. P., Coleman, R. C., Ireland, H. E., & Williams, J. H. H. (2004).Measurement of bovine IgG by indirect competitive ELISA as a meansof detecting milk adulteration. Journal of Dairy Science, 87, 215221.】,果汁造假的现象时有发生，比如掺水或是掺入一些人造的成分。随着果汁化学成分的研究深入，人们逐渐向果汁中加入一些果皮
34、的提取物或是兑入一些廉价的果汁。而为了保证消费者的权利，杜绝这种现象，就要求有一种安全、快速、可靠的检测技术。Sass-Kiss在柚子汁和橘子汁方面的掺假检验方面做了深入的研究。 【Sass-Kiss, A., & Sass, M. (2000). Immunoanalytical method for quality control of orange juice products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 40274031. Sass-Kiss, A., & Sass, M. (2002). Distribution
35、of various peptides in citrus fruits (grapefruit, lemon, and orange). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 21172120.】,转基因食品的不确定因素很多，如它或许可能会引起某些人的变态反应，因此在包装时要进行标注。而有些厂家并不在意这一点，这实际上是一种欺骗行为。为了规范转基因食品的市场，需要一种可靠的检测手段能够准确地检测出某种食品中是否含有转基因成分。ELISA在一些半成品或是生食中可以做为转基因食品的检测手段，但是对于完全加工的产品来说，由于转基因表达出来的
36、蛋白质降解，导致ELISA不能够认定该食品是否是转基因食品。而大量的研究也都证实了这一点。【Terry, C. F., Harris, N., & Parkes, H. C. (2002). Detection of genetically modied crops and their derivatives: Critical steps in sample preparation and extraction. Journal of AOAC International, 85, 768774.】【Margarit, E., Reggiardo, M. I., Vallejos, R. H
37、., & Permingeat, H. R.(2006). Detection of BT transgenic maize in foodstus. Food ResearchInternational, 39, 250255.】,辐照作为一种是食品加工技术主要应用在杀菌、延长某些蔬菜的贮藏期（如抑制马铃薯和洋葱发芽）以及防虫。而某些国家或组织规定辐照食品必须在包装上标明。一方面，为了方便国家对于辐照食品以及辐照源的管理；另一方面，为了消费者权益考虑，就需要一种快速可靠的辐照食品检测技术。Deeble等人利用ELISA技术针对DNA在辐照过程中的改变而对辐照食品进行快速检测。 【Deeble
38、, D. J., Christiansen, J. F., Jones, M., Tyreman, A. L., Smith, C. J.,Beaumont, P. C., et al. (1994). Detection of irradiated food based on DNA base changes. Food Science and Technology Today, 8, 9698.】,在某些食源性的变态反应中，即使少量的食物，也会引起很严重的后果。所以很有必要针对一些可能会引起某些敏感人群变态反应的食物成分进行快速有效地检测。而通常采用的方法就是ELISA。Kiening等人
39、采用ELISA的方法对于花生和榛子在一些食品中的含量的检测做了研究。【Kiening, M., Niessner, R., Drs, E., Baumgartner, S., Krska, R., Bremer,M., et al. (2005). Sandwich immunoassays for the determination of peanut and hazelnut traces in foods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 33213327.】 Williams等人通过ELISA对零食和面条中鸡蛋的检测做了研究。而鸡蛋是引起幼儿过敏反应的重要物质之一【Williams, K. M., Westphal, C. D., & Shriver-Lake, L. C. (2004).Determination of egg proteins in snack food and noodles. Journal of AOAC International, 87, 14851491.】。,thanks for your time,
