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1、DNA重组技术、转基因技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的新的生物类型或生物产品,基因重组,一、基因工程的概念,优点：,克服远缘杂交不亲和的障碍,定向改造生物的遗传性状,与杂交育种相比,与诱变育种相比,1基因拼接的理论基础（从结构上分析，为什么不同生物的DNA能够重组?）(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子都是规则的双螺旋结构。,一、基因工程诞生的理论基础,2外源基因在受体内表达的理论基础(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。（遗传密码破译）,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，
2、并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(6个,4、5、8个),（2）作用：,（4）结果：,形成两种末端,1、限制酶“分子手术刀”（小结）,切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。,磷酸二酯键,大本 考向对练 （2）书写,限制酶存在于原核生物中的作用是什么?,思考,原核生物容易受到外源DNA的入侵限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效,限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA?,思考,防御机制,1.原核生物中不存在该酶的识别序列,2.识别序列被修饰，让限制酶不能切割 如在甲基化酶 的作用下把甲基转移到碱基上,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？
3、可产生几个黏性末端？,提问,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把限制酶来切割的黏性末端能相连，那么这两种酶必须满足的条件是？,这两种酶切割的片段会产生相同的黏性末端，,双酶切指用两种限制酶分别切割切割目的基因和载体，这样做的优点是？,防止目的基因和载体的自身环化，并防止目的基因的反向连接，从而确保目的基因定向插入到特定位置,2.“分子缝合针”DNA连接酶,(2)分类注意书写,E.Coli DNA连接酶,T4 DNA连接酶,想一想:DNA连接酶与DNA聚合酶功能的异同？,(1)来源： (2)作用：,(1)来源：(2)作用：,(1)作用：,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。,大肠杆
4、菌“缝合”黏性末端,T4噬菌体“缝合”黏性末端和平末端,DNA连接酶与DNA聚合酶功能的异同,将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上。,形成磷酸二酯键,以一条DNA链为模板。,将两个双链DNA片段之间的切口连接起来。,不需要模板。,为什么要用载体？,3. “分子运输车” 基因进入受体细胞的载体：,1、无法复制（原因）2、无法表达（原因）3、目的基因是否进入到受体细胞需要借助于载体上的标记基因简单快速的检测出来。4、基因直接进入细胞的概率很低；,作为载体必须具备哪些条件,1）能够在受体细胞中复制，使目的基因稳定存在。2）具一至多个限制酶切点，以便外源基因插入。3）具有某些标记基因，供重组DNA的鉴定
5、和选择。,天然的DNA分子可以直接作为载体吗？为什么？1、载体DNA必须具备自我复制能力2、载体DNA必须具备一到多个合适的酶切位点供目的基因插入。3、载体DNA必须带有标记基因。4、载体DNA必须安全并大小合适。实际上天然的DNA并不完全具备上述条件，都要进行人工改造。,一.目的基因的获取,1、目的基因主要是指 _也可以是一些具有调控作用的因子。,编码蛋白质的结构基因,3、常用方法：,人工合成法,反转录法,化学合成法,利用PCR技术扩增,从基因文库中获取,2、获得途径,从自然界已有物种中分离,人工方法合成,基因文库,基因组文库,部分基因文库（如:cDNA文库）,基因文库？,(1) 从基因文库
6、中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,基因组文库与cDNA文库的比较P10表,小,大,有,无,有,无,某种生物的全部基因,某种生物的部分基因,部分基因可以,可以,（2）利用PCR技术扩增目的基因,1、定义：PCR多聚酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 通过此技术，可获取大量的目的基因。,DNA复制,2、原理：,3、条件：,4、过程：,一段已知目的基因的核苷酸序列,一对引物；模板DNA；dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；,6、仪器：,PCR扩增仪
7、,根据这一序列设计相应的引物,为什么？,PCR反应过程,PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但_的引物需要设定更高的退火温度。,引物与模板 GC含量高,（3）人工合成 原理 （2条？）,反转录法：,目的基因的mRNA,杂交双链(单链RNA/单链DNA),单链DNA,逆转录酶,DNA聚合酶,双链DNA(cDNA),根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的脱氧核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,3.基因表达载体的组成：,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d
8、、标记基因为什么不能将基因直接导入受体细胞？,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合位点。,位于基因的尾端,终止转录。,鉴别并筛选含有目的基因的受体细胞。,2、基因表达载体的作用,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,三、将目的基因导入受体细胞,目的基因进入_ _内，并且在受体细胞内维持_ _和_ _的过程。,转化:,受体细胞,稳定,表达,1、导入植物细胞:,2、导入动物细胞:,3、导入微生物细胞:,常用方法：,农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞法（或Ca2+转化法）,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点
9、:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体DNA上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,农杆菌的作用？,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：,常用受体细胞：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,（用Ca2+处理，增加细菌细胞壁的通透性）,感受态细胞法（或Ca2+转化法）,为什么把大肠杆菌处理成感受态细胞？,(1)_目的基因的有无，。关键(2)分子杂交技术
10、_是否发挥作用的第一步(3)_目的基因是否翻译(4)生物性状的表达与否 抗虫抗病接种实验抗逆实验，蛋白质功能活性的比较(个体水平),DNA分子杂交技术,目的基因是否转录,抗原抗体杂交,分子水平,四、目的基因的检测与鉴定 每项技术原理是什么？,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,1、导入检测,目的：,方法：,DNA分子杂交技术,过程：,.首先取出转基因生物的基因组DNA.将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针。使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中,四、目的基因的检测与鉴定,从转基因生物中提取的基因组DNA,探针：,杂交
11、的对象：,用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段,15N,15N,14N,探针,转基因生物的DNA,变性,变性,14N,2、转录检测,目的：,检测目的基因是否转录出了mRNA,方法：,分子杂交技术,用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段,探针：,杂交的对象：,从转基因生物中提取的mRNA.,3、翻译检测,目的：,检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法:,抗原抗体杂交技术,从转基因生物中提取的蛋白质,抗原：,抗体：,将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体,4、个体生物学水平的鉴定,课本24 用于基因治疗的基因种类正常基因：从健康人体上分离得到的功能正常的基因，用以取代病变
12、基因，或依靠其表达产物。反义基因。即通过产生的mRNA分子，与病变基因产生的mRNA 进行互补，来阻断非正常蛋白质的合成。自杀基因：即编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因。,(4)对天然蛋白质进行改造，应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？_。原因是：_。,应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造,首先，天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因也就是对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以通过改造过的基因遗传下去。如果对蛋白质直接改造，一方面蛋白质空间结构复杂，改造困难，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子也无法遗传；其次，对基因进行改造比对蛋白质直接进行改造要容易操作，难度要小得多。,获取目的基因（例如血清白蛋白基因）构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）显微注射导入哺乳动物受精卵中形成胚胎将胚胎送入母体动物发育成转基因动物（只有在产下的雌性个体中，转入的基因才能表达）。,思考:用基因工程技术实现动物乳腺生物反应器来生产人类血清白蛋白的操作过程是怎样的？,乳腺生物反应器的优点：产量高；质量好； 成本低；易提取。,
