双荧光素酶系统实验操作步骤及方法ppt课件.ppt
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1、双荧光素酶报告系统,报告基因 (reporter gene):是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,也就是说,是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。 一般的,把报告基因的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因,或与其它目的基因相融合,从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。在动物基因表达调控的研究中,报告基因被广泛应用。如绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶。,一、概述,荧光素酶(Luciferase):是能够催化不同底物氧化发光的一类酶的统称,哺乳细胞无内源性荧光素酶。荧光素酶报告基因的优点蛋白不需要翻译后加工,所以一旦翻译立即产生报告活性。在所有的化学发光反应中,它的光产物具有最高
2、的量子效率,因而非常灵敏。另外,在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光。检测快速,每个样品只需几秒钟。,构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞,适当刺激或处理后裂解细胞,测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。,二、实验原理,利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性,把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因(firefly luciferase)的上游,,同时,为了减少内在的变化因素(如:培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率等)对实验准确性的影响,将带有海肾荧光素酶基因(Rinilla luciferase)的质粒(p
3、hRL-TK)作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞,提供转录活力的内对照,使测试结果不受实验条件变化的干扰。在测量过程中,当加入荧光素酶检测试剂II (LARII)时产生萤火虫荧光信号,这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。定量萤火虫荧光强度之后,再在同一样品中加入Stop & Glo 试剂,将上述反应淬灭,并同时启动海肾荧光素酶反应,同时进行第二次测量。,A检测前相关试剂配制 1. 1X PLB裂解缓冲液配制:将4体积水或PBS加入1体积5X PLB裂解缓冲液。(使用前在室温平衡1X 缓冲液,平衡需2-3 min)。 2. Luciferase Assay Reagent II (LAR II)
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