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1、第10章 发酵液预处理和过滤,微生物菌体及残存的固体培养基外，还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物的各种代谢产物。,发酵液成分,目的,分离菌体和其他悬浮颗粒，除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各工序的顺利进行。,对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物转移到液相，然后经固液分离除去固相； 对于胞内产物，则应首先收集菌体或细胞，经细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎片分离。,方 法 选 择,1 、发酵液过滤特性的改变2、 发酵液的相对纯化3、 固液分离工程及设备,主要内容,1 、发酵液过滤特性的改变,发酵产物浓度较低，大多为1一10，悬浮液中大部
2、分是水； 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。,1.1 微生物发酵液的特性,1.2 改善发酵液过滤特性的物理化学方法,通过对发酵液进行适当的预处理，即可改善其流体性能，降低滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。 1. 降低液体粘度： 根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，降低液体粘度可有效提高过滤速率。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。 有加水稀释法和加热法,H值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电
3、荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。 氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染； 细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH值下 也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。 主要有等电点沉淀法,2. 调整pH,采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。,3. 凝聚与絮凝,助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上
4、，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。,4. 加入助滤剂,常用的助滤剂,硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等。 最常用的是硅藻土，使用时，通常细粒用量为500 g/m3；中等粒度用量为700 g/m3；粗粒用量为700-1000 g/m3。,加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固改善过滤性能；如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤
5、剂，可提高过滤效率5倍。 不影响目的产物，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，提高过滤速率。,5. 加入反应剂：,1.3 凝聚与絮凝,采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。,凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。 凝聚值：使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度。 反离子的价数越高，该值就越小，即凝聚能力越强。,1、凝 聚,阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：,Al3+ Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+
6、 Li+,常用的凝聚剂电解质有：,硫酸铝 Al2(SO4)318H2O（明矾）；氯化铝 AlCl36H2O;三氯化铁 FeCl3;硫酸亚铁 FeSO47H2O ；石灰；ZnSO4；MgCO3,发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态，因此常加入阳离子对发酵液进行凝聚。,2、絮 凝,絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离,絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如-COOH
7、）或阳离子（如-NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。,高分子絮凝剂的吸附和絮凝作用示意图,1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。,目前最常见的高分子聚合物絮凝剂,有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物,根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三
8、类：非离子型、阴离子型（含有羧基）阳离子型（含有胺基）,工业上使用的絮凝剂可分为三类：,聚丙烯酰胺絮凝剂,聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点,用量少，一般以mg/L计量；絮凝体粗大，分离效果好；絮凝速度快；种类多，适用范围广。,聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点,存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。,医药和食品工业其它絮凝剂,聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）。,影响絮凝的因素,絮凝剂的加量絮凝剂的分子量溶液的pH搅拌速度搅拌时间,对
9、于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理。,（3）混凝,2、发酵液的相对纯化,发酵液中杂质很多，其中有些杂质不仅直接影响产品质量利收得率，同时对后继提取和精制有很大影响。,发酵液中的杂质,（1）高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+） 在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。,存在对处理的影响：在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两
10、相分离不清。在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。 因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。,（2）可溶性杂蛋白,1. Ca2+ ：草酸、草酸钠形成草酸钙沉淀 但草酸价格较贵，加入硫酸铅，在60下反应生成草酸铅。后者在9095下用硫酸分解，经过滤、冷却、结晶后可以回收草酸。 草酸镁的溶解度较大。故加入草酸不能除尽镁离子。要除去镁离子，可以加入三聚磷酸钠，它和镁离子形成可溶性络合物 Na5P3O10MgMg Na3P3O102Na十,2.1 高价无机离子的去除方法,2.Mg2+：三聚磷酸钠形成三聚磷酸钠镁 （可溶性络合物）3.Fe2+ 黄血盐，普鲁士兰沉淀,高价无机离子的去
11、除方法（续）,蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。在酸性溶液中带正电荷；在碱性溶液中带负电荷。在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小， 称为等电点。,2.2 杂蛋白的去除方法,在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、Cu+、Zn+、Fe+和Pb+等形成沉淀。由于羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性质通常强于碱性，因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH 4.05.5）。但单靠调节pH至等电点的办法不能将大部分蛋白质除去。,（1）. 酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀,加热，大幅度调节
12、pH值，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处:加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。,（2）. 变性法,加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。,（3）. 吸附法,3、固液分离工程,范围：培养基、发酵液、某些中间产品和半成品。其中发酵液由于种类多、粘度大和成分复杂，分离最为困难。
13、方法：分离筛、重力沉降、浮选分离、离心分离和过滤等，其中用于发酵液固液分离的主要是离心分离和过滤分离。,1.原理：利用转鼓高速转动所产生的离心力，来实现悬浮液、乳浊液的分离或浓缩。2.优点：分离速率快、分离效率高、液相澄清度好等。3.缺点：设备投资高、能耗大。此外，连续排料时，固相干度不如过滤设备。4.种类：种类多，按其作用原理不同，可分为过滤式离心机和沉降式离心机两大类。,3.1 离心分离,5.离心机种类：,a. 碟片式离心机,b.管式离心机,C. 倾析式离心机,3.2 过滤,微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或 细胞碎片以及残余的固体培养基成分。过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分
14、离的过程。在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清，并且有高的收率。,过滤（续）,1.原理：悬浮液通过过滤介质时，固态颗粒与溶液分离。2.类型： 澄清过滤 滤饼过滤,过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等。 当悬浮液通过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清。 适合于固体含量少于0.1g/100mL、颗粒直径在5-100um的悬浮液的过滤分离，如河水、麦芽汁、酒类和饮料等的澄清。,（1）澄清过滤：,过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布、玻璃纤维纸、合成纤维等无纺布。 当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤渣）。当滤饼至一定厚度时即起过滤
15、作用，此时即可获得澄清的滤液，这种方法叫做滤饼过滤。在滤饼过滤中，悬浮液本身形成的滤饼起着主要的过滤作用，适合于固体含量大于.1g/100mL的悬浮液的过滤分离。,（2）滤饼过滤,滤饼的比阻值,滤饼的质量比阻力rB：是衡量过滤特性的主要指标，它表示的是单位滤饼厚度的阻力系数，与滤饼的结构特性有关。 rB=r（p）m式中：r不可压缩滤饼，对一定的料液其值为常数 m压缩性指数，一般取0.5-0.8，对不可压缩性滤饼为0； p-压力差（Pa）,过滤方程式,对于可压缩滤饼，如果过滤介质的阻力相对较小，可以忽略不计，则恒压下的过滤方程式为： q2=2（p/rBXB)式中：q到瞬间时，通过单位过滤面积的滤
16、液量；p-压力差（Pa）；滤液黏度（Pa S）；rB滤饼的质量比阻（m/kg）XB通过单位体积滤液所形成的滤渣质量（kg/m3）过滤时间（s）,比阻值,质量比阻可根据上式，利用图解法求得， /q为纵坐标，以q为横坐标所得的直线斜率为M，则rB可按下式进行计算： rB=2M p/XB 根据滤饼的质量比阻值，可以衡量各种不同发酵液过滤的难易程度。,3、 影响发酵液过滤因素,发酵液过滤速度受到以下几方面的影响：（1）微生物种类；（2）培养基的组成；（3）发酵结束培养基浓度；（4）消泡剂；（5） 发酵周期。,4、提高过滤性能的方法,对难以过滤的发酵液，需要通过改善过滤性能，降低滤饼比阻值的方法来提高过
17、滤速度,，常用的方法有：（1）等电点法；（2）蛋白质变性；（3）吸附；（4）凝聚和絮凝；（5）加入助虑剂；（6）添加填充凝固剂；（7）酶降解。,广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。 优点：过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。缺点：不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。,5. 常用过滤设备,（1）板框压滤机,单元组成,操作注意点,尽量使工作时间和辅助时间接近；降低滤液粘度,（2）硅藻土过滤机,硅藻土：较纯二氧化硅矿石。化学性能稳定，具有极大的吸附
18、和渗透能力，是良好的介质和助滤剂。使用方法： a. 作为深层过滤介质，以过滤含少量(0.1)悬浮固形物的液体。硅藻土不规则粒子间形成许多曲折的毛细孔道，筛分和吸附作用除去悬浮液中的固体粒子。,b. 在支持介质(滤布)的表面上预涂硅藻土薄层(预涂层)，以保护支持介质的毛细孔道在较长时间内不被悬浮液中的固体粒子所堵塞，从而提高和稳定过滤速率。c. 将适当的硅藻土分散在待过滤的悬浮液中，使形成的滤饼具有多孔隙性，降低滤饼的可压缩性，以提高过滤速率和延长过滤操作的周期。用量：预涂，500g/m2左右，2-4mm厚,加入0.1左右。,思考题:,1.为什么要进行发酵液预处理？2.絮凝和凝聚的定义和区别。常用的絮凝剂3.发酵液分离的主要方法.4.分离和过滤的主要设备有哪些?,
