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1、实验 七,大肠杆菌感受态细胞的制备与转化,1、学习掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法2、学习和掌握热激法转化大肠杆菌的原理和方法3、把实验六连接反应产物进行转化实验,实验目的,1）相关名词概念 将质粒导入大肠杆菌或其它细胞内的过程叫作转化。 与噬菌体不同，质粒本身不具备感染细胞的能力。为了使细胞能吸收外来DNA，必须改变其细胞生理状态，使之具有很高的接收外源DNA的能力，这种具有接收外源DNA能力的细胞叫感受态细胞。2 ） CaCl2- 热激法转化原理 CaCl2能改变细胞膜的通透性，大肠杆菌经低渗CaCl2溶液致敏处理，就变成高效的感受态细胞；感受态细胞与质粒混匀于0时，混合
2、物中的DNA形成抗DNase羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，再经42 短时热激时进入细胞内实现转化，利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落。,实验原理,1、材料 菌株：E.coli TOP10 质粒：pBI121-chs(实验六连接反应产物) 2、试剂 LB液体培养基、LB/Amp(100ug/mL)固体培养皿、灭菌0.1mol/L CaCl2、灭菌去离子水,试剂与器材,实验步骤,（一） CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞1）挑取纯化的大肠杆菌TOP10单菌落接种于盛有5 mL LB液体培养基的小三角瓶里，37，180rpm振荡培养过夜；2）取1 mL培养菌液接入100
3、mL液体培养基中，37 180rpm振荡培养至OD600为0.5-0.6，冰浴15min； 3）将菌液分别移入1.5mL无菌EP管中，4，4000rpm离心5min，弃上清，沉淀用1mL预冷的0.1M CaCl2 （过滤灭菌）悬浮，用枪头轻轻混匀，冰浴15 min；4）4，4000rpm离心10min，弃上清，沉淀再加200L预冷的0.1M CaCl2，轻轻重悬，冰上放置0.55小时后，即可用于转化；或每管加灭菌甘油至终浓度15%，混匀，液氮冷激后置于-70冰箱保存。,（二）热激法转化E.coli TOP10 1）将连接产物10L转移至装有200L感受态细胞的1.5mL 离心管中，轻轻混匀（并
4、设置1管负对照：200L感受态细胞悬液+10L无菌双蒸水）； 2）冰浴30min后，42热激90sec, 冰浴2min； 3）加入800L无抗生素的LB液体培养基，在37小于180rpm下振荡培养0.51小时； 4）复苏后的菌液在4000rpm下常温离心3min，吸取上清液900L留约100L 菌液在离心管底部，并用移液枪轻轻吹打重悬； 5）用移液枪将重悬菌液移入带有相应抗生素（Amp:100g/mL,平板表面涂有20mg/mL的X-gal 40L和20mg/mL的IPTG 40L）的37保温的LB固体培养基平板上，用灭菌的涂布器涂布均匀； 6）将平板倒置于37恒温箱中培养1218小时。,实验预期结果,作 业,1、详细描述你的实验结果，并分析实验中应注意的细节2、可将外源基因转化受体细胞的方法有哪些？,
