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1、天然产物抗氧化活性测定方法,抗氧化的两种定义,食品体系中：抗氧化是能够阻止或延缓食品的氧化，用于提高食品的稳定性及延长储藏性生物体系中：能够明显阻止和延缓被氧化物质的氧化，其中被氧化物质包括脂类、蛋白类、糖类以及DNA,抗氧化的天然产物,抗氧化活性,抗氧化能力,常用的抗氧化能力评价方法: 1、对底物脂质过氧化抑制能力 2、对特定的自由基的清除能力 3、对底物的还原能力,带来问题：,各有特色各有优势各有局限,无法正常评价的原因：1)抗氧化活性的化学测定方法无法真实模拟生理环境，没有考虑药物跨膜进入细胞、药物吸收及其与载体或酶等生物大分子之间的相互作用 2)体内新陈代谢作用大大增加了活性物质抗氧化
2、能力的不确定性，未考虑代谢毒性及生物有效利用性 3)生物体抗氧化反应途径多样复杂，各体系间相互作用 4)抗氧化剂与生物体液一般是混合的，其中每一种物质对不同测量方法的贡献不同 5)测定的样品大多为植物提取物，成分复杂，其抗氧化作用无法用单一的机制解释 6)抗氧化活性还受很多因素如在水相和有机相间分配效应、氧化条件和环境以及氧化底物物理状态等的影响,天然产物中抗氧化的物质,抗氧化活性研究模型,体外模型,Diagram 2,Diagram3,Diagram 2,Diagram 3,细胞损伤模型,体内模型,体外测定方法分类,1、抗脂质氧化,2、清除和抑制自由基,3、测定还原能力,4、其他方法,抗脂质
3、氧化类型检测方法,基本原理：脂质中的不饱和脂肪酸自动氧化，生成不稳定的氢过氧化物，氢过氧化物继续分解形成短碳链的醛、酮、酸等小分子化合物。抗氧化剂的加入可以延缓氢过氧化物及其分解产物的形成，由此可测得抗氧化活性。常见方法：过氧化值(peroxide value，PV)法共轭二烯过氧化物法硫氰酸铁法(ferric thioeyanate method，FTC)硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid，TBA)2，4-二硝基苯肼法克雷斯实验法(Kreis test)茴香胺值(anisidine value),抗脂质氧化类型检测方法,测定氧化前期的有PV法/共轭二烯过氧化物法/FTC法
4、测定氧化后期的有TBA、克雷斯实验法/茴香胺值法,抗脂质氧化方法原理,常见,清除和抑制自由基方法,基本原理：体内自由基过剩，会对机体产生损伤。通过测定抗氧化剂清除自由基的能力来评价抗氧化活性,常见方法： 1、ABTS、DPPH法、DMPD法、Fremy自由基和galvinoxyl法 2、氧自由基吸收能力(ORAC)法、清除抗氧化能力(TRAP)法、二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法、总氧自由基清除能力(TOSC)法、化学发光法、藏花素漂白法、B一胡萝卜素漂白法、总氧自由基清楚能力（TOSC）,自由基的分类,涉及到总抗氧化性测定的方法,清除抗氧化能力(TRAP)法氧自由基吸收能力(ORAC)
5、法二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法总氧自由基清楚能力（TOSC）藏花素漂白法,TRAP法和ORAC法,两种方法均利用在自由基会抑制某种蛋白产生荧光，抗氧化剂的出现会抑制这种抑制作用的产生，利用荧光强度反应抗氧化活性TRAP是一种常用的检测血浆和血清体系的总抗氧化能力的方法，检查的是非酶类的抗氧化物质 缺点：反应滞后时间与抗氧化能力不总是成正比例ORAC法该法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法，主要检测抗氧化物质对由AAPH产生的过氧化自由基的清除效果。该过程发生在37下，借助氢原子的转移来实现。 缺点：仪器设备较复杂，检测成本较高,二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法,DCFH-DA
6、(二氧荧光素二乙酸酯)法也是测定总的自由基清除能力。AAPH产生的过氧自由基氧化DCFH-DA生成DCF(dichlorofluorescein，二氯荧光黄) 。DCF有很强的荧光，在504 nm有吸收，因此可用荧光法或分光光度法检测。,总氧自由基清楚能力（TOSC）,TOSC(自由基清除能力)法是一种相当新的测量体外抗氧化活性的方法。此法是根据过氧自由基、过氧化氮或OH将KMBA氧化生成乙烯，生成的乙烯可用顶空气相色谱检测。在有抗氧化剂存在时，抗氧化剂与KMBA对过氧自由基竞争反应，乙烯的形成被部分地抑制。,藏花素漂白法(crocin bleaching test),藏花素漂白法(croci
7、n bleaching test)用于测定复杂混合物和食品的抗氧化能力。藏花素是一种天色化合物(类胡萝卜素的一种),在可见光区(443nm有强吸收。在有过氧自由基(可由AAPH或ABAP热分解生成)时,藏花素颜色变浅(被漂白);添加抗氧化剂后,藏花素的漂白速率减慢缺点：藏花素本身也是一种抗氧化剂,DPPH法,DPPH法是1950年代提出的，最初用于发现食物中的供氢体，后来广泛用于定量测定生物试样、酚类物质和食品的抗氧化能力。DPPH(2， 2-diphenyl1picrylhydrazyl， 2，2-二苯代苦味酰基苯肼)是一种稳定的自由基，其乙醇溶液显紫色，在515 nm处有最大吸收。当有供氢
8、能力的抗氧化剂存在时(如酚类)，DPPH溶液的颜色变浅，吸光度值变小。根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的活性。缺点：自由基为人工产生，非人体内所有。自由基选择性强，不和只有一个羟基的芳香酸、无羟基的类黄酮反应,ABTS法,ABTS法中ABTS可被各种试剂氧化生成蓝绿色的自由基阳离子ABTS+，ABTS+相当稳定。在有供氢能力的抗氧化剂(如酚类物质)存在下，ABTS+与之反应，变成没有颜色的ABTS。用于测定组织样品中血红蛋白的含量。改进后用于测定生物样品的抗氧化活性，广泛应用于食品和天然水溶性酚类物质抗氧化活性的测定,测定还原能力方法,基本原理：该类方法测定的是抗氧化剂的还原能力，主要方法有铁离
9、子还原测定、铜离子还原测定、总酚测定和循环伏安法，此外还有其它一些金属离子的还原测定，如锰离子等常用的铁、铜离子还原法，总酚测定法,铁离子还原能力(FRAP)法,经常使用的是基于氧化还原反应的比色法当体系里PH值小于7时，体系当中的Fe3+一TPTA(Fe3+一三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成Fe2+一TPTz，体系的颜色会成为深紫色，产物在593nm处有强吸收峰。优点：简单，易操作，可以重复。该方法主要用在食品业，抗氧化剂开发领域。缺点：能还原三价铁的并非只是抗氧化剂，同时有些促抗氧化剂在试验中可能会无法体现，同时无法测定硫醇化合物的还原能力。,在SCI文章中出现频率最高的10种方法： DPPH
10、、羟自由基、超氧自由基、ABTS、FRAP、ORAC、总酚估计法、TBARS法、硫酸氰铁法、鳌合金属离子 国际化学学会在奥兰多第二届国际抗氧化方法会议上公认ORAC是最好的方法，推荐使用ORAC、总酚估计法,方法选择建议原则,测定抗氧化剂抗氧化活性的方法应满足如下要求:(1)能说明测试体系中发生的反应，并能用明确的动力学图解描述(2)测试要有再现性(3)测试效率要足够高(4)方法要相对简单(5)能连续检测(6)应使用与体内或食品有关的活性自由基(7)分析中被测物的浓度在食品中或在生物体内能够得到(8)除了适合纯溶液外，还适合复杂生物组织和天然产物的测定(9)水溶性的和脂溶性的化合物都适用,Thank you,
