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1、癌基因与抑癌基因 Oncogene and tumor suppressor gene,刘玲生物化学教研室,细胞的正常生长与增殖受两类基因调控：正调节信号：促进细胞生长和增殖，并阻止其发生终末分化，调控失常时表现为肿瘤细胞的恶性生长，多数癌基因起作用； 负调节信号：抑制增殖，促进分化、成熟和衰老，最后凋亡，抑癌基因发挥作用。 癌基因与抑癌基因的作用机制涉及基因表达调控及细胞分裂、分化过程。癌基因编码类生长因子多肽及其受体分子，通过细胞内信息传递系统刺激细胞增殖。,第一节 癌基因(正调因素),癌基因概念病毒癌基因细胞癌基因癌基因产物及功能,癌基因概念,癌基因（ Oncogenes）：指细胞内控制
2、细胞生长、增殖和分化的基因，当它的结构异常或表达异常时，可以引起细胞恶性转化。一般是指编码生长因子、生长因子受体、细胞内生长信息传递分子，以及与生长分裂有关的转录因子等的基因。,癌基因的分类,病毒癌基因（virus oncogenes，v-onc.） ：是一类存在于肿瘤病毒（大多数是逆转录病毒）中的、能使靶细胞发生恶性转化的基因。如v-src等。细胞癌基因（cellular-oncogene, c-onc ）又称原癌基因（ Proto-oncogenes ） ：与病毒癌基因具有同源性，存在于正常组织细胞基因组中的静止或非活化状态的癌基因。如 c-myc、c-ras、c-src等。,一、病毒癌基
3、因(virus oncogenes),Rous Peyton ：The 1966 Nobel Prize in Physiology or Medicine,Rous 肉瘤病毒（RSV）,鸡肉瘤病毒（RSV）基因组结构图,在逆转录病毒的双链cDNA 合成过程中，病毒5端和3端的独特序列重复复制，两末端各增加了另一端的U序列，从而形成长末端重复序列LTR（long terminal repeat）。LTR中含有病毒的启动子和增强子.,Proto-oncogenes,逆转录病毒的水平传播,二、细胞癌基因,存在于正常细胞中，具有促进正常细胞生长，增殖，分化和发育等生理功能，为了与被激活后能使细胞恶性
4、转化的癌基因区分开来，而将正常细胞内未激活的癌基因称为原癌基因。,（一）病毒癌基因与细胞癌基因的比较,病毒癌基因在两端通常有序列的丢失；病毒癌基因无内含子，细胞癌基因通常有内含子或插入序列;病毒癌基因常会出现碱基取代或碱基缺失；病毒癌基因与同源的细胞癌基因在外显子序列有一定程度的差异；病毒癌基因表达的蛋白质往往有较强的细胞转化活性。,细胞癌基因的特点,普遍性：广泛存在于生物界中；保守性：在进化过程中，基因序列呈高度同源性；重要性：表达产物精密调控细胞增殖、分化和凋亡；危害性：表达产物结构和数量上的变化，可致细胞癌变或肿瘤生成。,c-onc在正常细胞中表达水平很低，也不具有使靶细胞恶性转化的功能
5、，当其受到某些因素的作用而“活化”或过度表达时，才会引起细胞的恶性转化。,（二）细胞癌基因的功能,1.参与细胞生长的调节：如AP-1（Jun/Fos二聚体），受到生长因子转导的信号而活化，小G蛋白（ras表达产物，转导细胞生长及增殖）、酪氨酸蛋白激酶（src家族的基因产物，生长因子受体）。2.与某些细胞分化有关：如c-src是在神经元分化过程中起作用，与增殖无关。,癌基因分类,按癌基因家族分类按功能分类,家 族 成 员 产物作用 产物定位src家族： src、abl、fgr、fes、 TPK活性 膜内侧或跨膜 yes、fps、 lck、kek、 fym、lyn、tklras家族： H-ras、
6、K-ras、N-ras 小G蛋白， 膜内侧 myc家族：c-myc、N-myc、L-myc 核内DNA 核内 结合蛋白jun、 fos 转录因子（AP-1） 核内 sis家族： 仅sis 类似PDGF，能刺激 胞外 间叶组织的细胞分裂繁殖。 myb家族：myb、myb-ets 转录因子 核内,按家族体系分类,（三）细胞癌基因活化,原癌基因的活化：从正常的原癌基因转变为具有使细胞转化功能的癌基因的过程。激活因素：在某些条件下，如病毒感染、化学致癌物或电离辐射等，癌基因可被相继激活而异常表达，致细胞恶变以及肿瘤生成。不同的原癌基因在不同情况下，可通过不同的途径被激活，成为“活化癌基因”。癌基因活化
7、后的结果： 1. 表达时机改变 2. 过量表达 3. 产物异常,原癌基因恶性激活的机制,（一）获得启动子与增强子（二）基因易位(gene translocation)或重排（三）细胞癌基因扩增(amplication)（四）点突变(point mutation)（五）原癌基因甲基化程度降低而激活 (六)癌基因的协同作用,（一）获得启动子与增强子,细胞癌基因不但由于逆转录病毒基因组的启动子插入原癌基因的附近而被激活，甚至还会因获得正常细胞的强启动子而活化。,如ALV引起的淋巴瘤细胞中，c-myc的表达增加上百倍，导致鸡B细胞淋巴瘤。,（二）基因重排或染色体易位,染色体基因的易位和重排，可使原癌基
8、因移至某些强启动子或增强子附近而被活化，表达增强，致使肿瘤生成。,慢性粒细胞白血病的Philadelphia染色体为 t（9：22），使c-abl从9号染色体易位到22号染色体上的bcr基因旁，组成融合基因，表达bcr-abl融合蛋白，该产物有较高的蛋白酪氨酸激酶活性。,人Burkitt淋巴瘤中，位于8号染色体上的c-myc移到14染色体免疫球蛋白重链（IgH）基因的调节区附近，与此区活性很强的增强子连接而受到活化,伯基特淋巴瘤细胞的染色体易位t（8：14），致使c-myc激活,（三）原癌基因的拷贝数增加,即细胞癌基因扩增。染色体的一部分过度复制，成为多拷贝基因。如： 乳腺癌 erb B-2基
9、因 神经母细胞瘤 N-myc基因，扩增与疾病进展或临床阶段相关。 小细胞肺癌 myc家族基因,（四）点突变,在辐射和（或）致癌物作用下，细胞原癌基因发生点突变，可能造成其表达产物中氨基酸组成或结构改变，导致活化，至使肿瘤生成。 如：1982年，美国 3 家研究机构（麻省理工大学、国立癌症研究所和哥伦比亚大学）几乎同时发表实验结果：人膀胱癌细胞株EJ的恶性转化是由于其原癌基因 c-H-ras 发生点突变，导致Ras与GTP的结合不易分解而持续激活。 H-ras 正常细胞 GGC (12Gly) 肿瘤细胞 GTC (12Val),（五）原癌基因甲基化程度降低 （基因抑制消除）,DNA分子甲基化有稳
10、定双螺旋结构，阻抑转录的作用。 如结肠腺癌和小细胞肺癌中，c-ras基因比邻近正常组织中的甲基化程度明显降低，导致原癌基因激活。,(六)癌基因的协同作用,实验证明，用ras或myc同时转染细胞，可使细胞长期增殖，但不能转化成癌细胞 ，在裸鼠体内也不能形成肿瘤。但用ras+myc同时转染细胞，则使细胞转化成癌细胞。 说明：致癌至少需要2种或以上的onc协同作用，2种onc在2条通路上发挥作用，由于细胞增殖调控是多因子，多阶段影响的结果。而影响增殖分化的onc 达几十种之多，所以大多数人认为：癌发生是多阶段多步骤的。,第二节 抑癌基因（anti-oncogenes，tumor suppressor
11、 genes）,抑癌基因的基本概念抑癌基因作用机制Rb基因“控制细胞周期的 重要基因”p53基因“基因组的卫士”,一、抑癌基因的基本概念,概念：是指存在于正常细胞内的一类可抑制细胞过度生长、增殖的基因，具有潜在抑癌作用，当一对等位基因都明确失去功能时可导致肿瘤的形成。抑癌基因表达产物：主要包括跨膜受体，胞质调节因子，结构蛋白，转录因子，转录调节因子，细胞周期因子，DNA损伤修复因子等发现：1986年，美国加州大学的Geiser等用正常细胞与肿瘤细胞杂交实验发现并提出抑癌基因。,细胞杂交试验,确定抑癌基因的条件,在某些特定恶性肿瘤的相应正常组织中有正常表达；在恶性肿瘤细胞中发生变异或缺失，如点突
12、变、DNA片段或全基因的缺失等；将此基因导入恶性肿瘤细胞中能部分或完全抑制其恶性表型。,抑癌基因的功能,1. 编码转录因子，参与细胞周期的调节。 如Rb、P53、WT1（Wilms瘤）。2.参与DNA损伤修复后的复制，保证DNA遗传的稳定性。当损伤严重时诱发细胞调亡。如P53。3. 与细胞间的黏连有关。如直肠癌缺失(DCC)基因 。4. 连接细胞与细胞骨架，维持细胞的形态，防止细胞的异常生长。如神经纤维瘤 （neurofibromatosis，NF2） 基因 。5. GTP酶的活化因子，通过失活癌基因蛋白（Ras）而发挥抑癌效应。如NF-1。,常见的抑癌基因有Rb基因，p53基因，p16基因等
13、。其中，Rb基因编码P105Rb转录因子，p53基因编码P53转录因子，p16基因编码一种P16蛋白。,常见的抑癌基因,（一）Rb基因 (Retinoblastoma gene) “控制细胞周期的重要基因”,Rb是成视网膜母细胞瘤基因，为一种肿瘤抑制基因。在许多不同的肿瘤中处于突变状态，首次报导是它在眼部恶性肿瘤发生。这种病通常发生在幼儿中。Rb基因的蛋白质产物是一种转录因子，可控制驱使细胞进入分裂过程的重要基因表达。Rb基因即是世界上第一个被克隆和完成全序列测定的抑癌基因。,retinoblastoma,基因结构： Rb基因转录产物约4.7kb，表达产物为928个氨基酸组成的蛋白质，分子量约
14、105kDa，称为P105-Rb。Rb蛋白分布于核内，是一类DNA结合蛋白。Rb基因的表达产物为P105Rb，在细胞内存在低磷酸化型（活性型）和高磷酸化型（非活性型）两种类型。不同类型的P105Rb对转录因子E2F有不同的亲和力。,Rb蛋白的磷酸化/去磷酸化是其调节细胞生长分化的主要形式。 非/低磷酸化的Rb具有抑制细胞增殖的活性，是Rb的活性形式。 在细胞周期的G。,G1期，它表现为低磷酸化，在S、M期则处于磷酸化状态。 pRb105活性调节：高磷酸化无活性型和非/低磷酸化活性型，由Cyclin-CDK来调节。 pRb105功能：参与调节E2F等多种转录因子来控制细胞周期，影响细胞增殖和分化
15、。,（一）视网膜母细胞瘤基因（Rb基因）作用机制,G0 G1期,S期,E-2F,DNA,mRNA,DNA,c-myc,Rb基因失活后，其表达产物不能与E2F形成复合物，E2F处于持续激活状态，导致细胞增殖。,（二） p53基因 “基因组的卫士”,1. p53基因的发现 曾错误把P53基因定为癌基因-因当初从肿瘤细胞分离得到的P53基因如同myc基因一样，能和ras基因协同转化胚胎成纤维细胞，又依据癌基因为细胞显性表型的原则而被定为癌基因，后发现实为其突变型。 1989年，才确认为“抑癌基因”。p53基因与人类50%的肿瘤有关。P53基因突变型在血液系统肿瘤、膀胱癌、肝癌、肺癌、结肠癌以及口腔癌
16、等的细胞中发现。,基因：位于17p13.1，20kb，11外显子，mRNA：2.5kb，编码393氨基酸残基，分子量为53kDa的多肽链。,2. p53的结构,P53蛋白可分为三个结构域：N端的酸性区、中段疏水核心区与C端的碱性区，分子中有一核定位信号，所以它一般都位于核内。,P53蛋白可与特异的DNA片段结合，其酸性区域具有许多转录因子的共同特征，并与寡聚体的形成有关。P53蛋白能以四聚体的形式与DNA结合，调节其它基因的表达。,P53蛋白的生物学功能较为复杂，目前已知的功能有： 转录调节及抑制细胞生长的作用：P53蛋白促进WAF1/CIP1基因表达产生一种分子量为21kD的蛋白质（p21W
17、AF1/CIP1），诱导细胞生长停滞于G1期。, 抑制DNA复制：P53蛋白可与复制蛋白A(RPA) 结合，而RPA与解链状态的DNA单链的结合可能是DNA复制的起始步骤。P53蛋白与RPA结合后可抑制RPA与单链DNA的结合，从而抑制了RPA与DNA复制起始点的结合，阻止细胞进入S期。P53蛋白还可通过抑制解链酶的活性，以抑制DNA复制。, 参与程序性细胞凋亡：P53 蛋白使损伤细胞停留在G1期，以便使DNA损伤修复后再进入细胞周期。若损伤不能修复，则启动细胞进入程序性凋亡（细胞自杀）。,P53蛋白的作用机制（演示）,P53蛋白,解链酶,复制因子A,P21蛋白,细胞停滞于G1期,细胞自杀,D
18、NA损伤,P53蛋白,P53蛋白,二、癌基因激活与肿瘤的发生,肿瘤发生学说：多阶段假说 正常细胞中含有多种原癌基因，当受到某些理化因素，生物因素等致癌因子作用后，经过启动阶段（initiating stage）、促癌阶段（promoting stage）、演进阶段（progressing stage）最终转变成癌细胞。,多阶段假说,1.启动阶段(Initiating Stage)：细胞受癌性启动因子作用，DNA发生改变，成为癌前细胞，但表型正常。 各种干细胞及处于分裂增殖中的细胞对启动因子更敏感。2.促癌阶段(Promoting Stage)：在启动因子和促癌因子的协同作用下，细胞出现恶性。,
19、启动因子：低剂量，一次接触，本身有致癌性；促癌因子：需启动因子作用的基础，本身无致癌性，多次反复作用。3. 演进阶段(Progressing Stage)：为细胞恶变的巩固阶段。已经发生恶变的细胞中,少数细胞自主分裂增殖，形成新的小病灶，成为进一步浸润、转移的基础。,二、癌基因激活与肿瘤的发生,ras基因变异与肿瘤发生：P21与GTP持续结合，促进细胞生长作用；myc基因变异与肿瘤发生：t（8；14）使myc基因与免疫球蛋白重链基因融合而导致高表达；neu基因变异与肿瘤发生：点突变使其获得转化活性，常作为治癌药物的靶点； bcl2基因变异与肿瘤发生：t（14；18）使bcl2基因高表达，导致细
20、胞程序化死亡失效；mdm2基因变异与肿瘤发生：高表达可使抑癌基因如P53，RB失活，引发恶性肿瘤。,三抑癌基因失活与肿瘤发生,1.Rb基因：功能失活负调控作用丧失细胞生长失控肿瘤发生调节形式：磷酸化和脱磷酸突变形式：主要缺失和碱基突变2.p53基因：防止受损细胞进入细胞周期调节形式：G1/G2期检测点突变形式：点突变，缺失，移码，重排,四、肿瘤发生是多因素、多基因和多阶段相互协调作用的癌变过程,多种遗传缺陷：点突变、易位、基因重排、移码突变、缺失突变和插入突变等癌基因产物之间协同：核内癌基因产物与胞浆癌基因产物发生协调作用（前者使细胞永生，后者改变细胞形态，降低对生长因子和贴壁的要求） ，如Myc与Ras协同致癌癌基因与抑癌基因以及其它相关基因之间的协调 细胞的癌变是多步骤，多重打击的复杂过程。在肿瘤发生发展的各个阶段，至少需要两个或两个以上的不同的癌相关基因异常激活或失活，才有可能引起癌变。癌基因的激活与抑癌基因的失活协同致癌。,思考题1.名词解释：癌基因、抑癌基因、病毒癌基因、细胞癌基因2.病毒癌基因与细胞癌基因有什么不同？3.试述原癌基因激活的机制。,
