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1、,实时荧光定量PCR 主讲人：廖旭东,PCR定义,PCR 简称聚合酶链式反应。聚合酶链式反应，是指在体外，酶促合成特异性DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火和适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时的特点。,DNA聚合酶以单链DNA为模板，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。,PCR反应条件,PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4
2、0 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。,对于较短靶基因可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。,温度与时间的具体分析,变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板DNA变性，若低于93则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。,温度与时间的具体分析,退火(复性)温度与时间：退
3、火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长 度。,温度与时间的具体分析,对于20个核苷酸，55为选择最适退火温度的起点较为理想。 复性温度=解链温度-(510) 在解链温度允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。,温度与时间的具体分析,延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生
4、物学活性： 7080 150核苷酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/S/酶分子 高于90时， DNA合成几乎不能进行。,温度与时间的具体分析,PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1-2min是足够 的。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。,循环次数： 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,PCR的基本原
5、理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,实时荧光定量PCR技术：,利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。,如何检测荧光强度呢, 我们先来了解一下荧光探针。,荧光共振能量转移,要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念我们需要首先明确，那就是荧光共振能量转移( FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体和能量受体对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上
6、相互接近到一定距离(110 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。所以我们就检测不到它的荧光。,TaqMan-水解型探针,5端标记有荧光报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 ，即供体。 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 （荧光共振能量转移原理，FRET） Taq酶可水解探针,工作原理,在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶以引物为起点沿模板53方向延伸，合成一条新的DNA互补链。每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信
7、号，可以在循环过程中检测荧光.,那我们如何对起始模板进行定量呢？,接触过PCR的同学与同事知道我们是通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析的。我们现在先搞懂三个概念： 什么叫扩增曲线、荧光阈值、Ct值？,实时荧光定量PCR 原理,1、扩增曲线,2、荧光阈值,荧光信号阈值 （threshold ）： 荧光阈值即是阴性阳性标本的区分值。超过此荧光值的标本为阳性，低于此值为阴性的。我们把它设定在PCR扩增的指数期。 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即我们所说的基线 荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准差的10倍 手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照荧光
8、的最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过阈值,接触过PCR的同学与同事不知道有没有想过，为什么同一浓度的标本在纵坐标中最后的荧光强度会不同，同时有时候1X105的荧光强度跑得会比1X107还高？带着这个疑问我们先来看看第三点：CT值。,3、CT值,CT值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。,那CT值的特点是什么呢？我们为什么选择CT值这个参数来测算样本的浓度？让我们来看看CT值的特性。,4、CT值的重现性,Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；但初始模板基本一致 Ct
9、值则极具重现性,模板的浓度与CT值有必然联系，它极具重现性，而和最终的荧光值的大小没有太大必然的联系，有孔间差异（另非特异）。这就解释了我们之前的为什么同一浓度的标本纵坐标的最后的荧光强度会不同，同时有时候低浓度的荧光强度跑得会比高浓度的还高了。,扩增曲线、荧光阈值、Ct值这几个概念搞清楚了，让我们来看看PCR定量原理的公式：,定量原理,n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量（样本） Ex：扩增效率理想的PCR反应（Ex=1）： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n,在扩增产物达到阈值线时: M:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值
10、线设定以后,M是一个常数 M=X0 (1+Ex)Ct (1) 方程式(1)两边同时取对数得: lg M=lg X0(1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: lg X0= lg M- Ct lg(1+Ex) (3) Lg起始浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即CT值就可计算出样品中所含的模板量。,标准曲线,我们可以看到模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,确定未知样品的 C(t)值 （我们通过阈线能看到）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,绝对定量,总结,通过PCR，监测实时荧光强度的技术，我们可以从CT值算出样本的浓度，这就是实时荧光定量PCR。有时候我们会碰到标准曲线跑得不好或出不来，我们可以参照以前的阈值阈线，然后通过CT值去自己手工测算样品的浓度，但是如果没有一定的经验不建议大家这样去做，标准曲线跑得不好的话，作为一名合格的检验者，我们首要的问题就是要找出原因，而不是急于把结果发出。,完 谢谢大家！,
