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1、实验六大肠杆菌感受态细胞的制备和转化,基因工程的基本路线,PCR,质粒DNA提取和酶切,连接,转化,操 作 步 骤,（一） 受体菌的培养 1、70或20低温冰箱取出菌种后，在LB培养液中培养过夜，进行活化;2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于37培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37振荡培养2-3小时至OD600 0.5左右(生长对数期）。（注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态
2、细胞后其接受外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。）,（二）、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将1.5ml菌液移入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4下5000rpm离心5分钟。2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余的过多水分）。3、加入1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻拨动管底使细胞完全悬浮,冰上放置15分钟后,4下5000rpm离心5分钟。 3、弃去上清,加入0.2ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞，即制成感受态细胞。将感受态细胞悬液分装成2份(1.5ml管)，每份100l（注意悬液密度要均匀）。冰上放置备用
3、。4、暂时不用的感受态细胞可置于 -80保存。,注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！,（三） 质粒pUC19的转化 （两人一组，1人做质粒转化，1人做对照）质粒和感受态细胞混和：分别在100l感受态细胞悬液中加入下列DNA质粒或水，轻轻摇匀后冰上放置30分钟。 感受态细胞 + pUC19质粒 2l (10ng/ul,含量不超过50ng,体积不超过10l) 感受态细胞 +无菌水 2l （阴性对照）热击：42水浴中热击90秒（注：精确计算时间，过长将对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。 复苏：向每管中加入400l LB液体培养基(注：不含Amp),混匀后37
4、轻摇培养11.5小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。,实 验 目 的,掌握氯化钙法制备与转化感受态细胞的原理、方法和技术。 学会对质粒转化结果的评估 。,实 验 原 理,转化(Transformation) 是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。细胞经过一些特殊方法（电击法、 CaCl2法等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞(Com
5、penent cells)。,0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液,在0冷冻处理大肠杆菌细胞时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击下，细胞可吸收外源DNA。 摄入了外援DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，表达外源基因。带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。,Ampr：抗氨苄青霉素 内酰胺酶:一类具有不同底物专一性、催化水解内酰胺的酶,多克隆位点：外源DNA片段的插入位点,Amps菌株,Ampr,涂布于含Amp的培养基上，可以生长。次日可见白色菌落- 转化子。,培养基上含有X-Gal和IPTG
6、时，可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子。,蓝白斑筛选的原理（ -互补）,UC19载体带有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主细胞编码-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶（ -半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为-互补。由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。,蓝白斑筛选的原理（ -互补）,现在使用的许多载体都带有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前1
7、46个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主细胞编码-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶（ -半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为-互补。 由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒
8、的细菌形成白色菌落。,材料、设备及试剂,材料E. coli DH5菌株: R-、M-、Amp- (转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。）pUC19质粒DNA（浓度：10ng/l): 购买或实验室自制设备：恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；无菌工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。,试剂 1、LB固体和液体培养基 LB培养基配方：（单位g/L） 胰蛋白胨 10 酵母提取物 5 NaCl 10 琼脂（1.5%） 15g （注：LB培养液不加琼脂） 按配方称量
9、药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。121湿热高压灭菌20-30分钟，待冷却至60左右,在超净工作台中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100g/ml,摇匀后用培养皿铺板。,2、Amp母液： 称取氨苄青霉素100mg溶于1mlddH2O中，0.22m滤器过滤除菌，用EP管分装后储存于-20冰箱. 3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0.22m滤器过滤除菌or高压灭菌。EP管分装于0冰箱储存 .4、标准pUC19质粒
10、：浓度10ng/l,操 作 步 骤,（一） 受体菌的培养 1、70或20低温冰箱取出菌种后，在LB培养液中培养过夜，进行活化;2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于37培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37振荡培养2-3小时至OD600 0.5左右(生长对数期）。（注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。）,（二）、 感受态细胞的制
11、备 ( CaCl2 法) 1、将1.5ml菌液移入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4下4000rpm离心5分钟。2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余的过多水分）。3、加入1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻拨动管底使细胞完全悬浮,冰上放置15分钟后,4下4000rpm离心5分钟。 3、弃去上清,加入0.2ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞，即制成感受态细胞。将感受态细胞悬液分装成2份，每份100l（注意悬液密度要均匀）。冰上放置备用。4、暂时不用的感受态细胞可置于 -80保存。,注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作
12、！,（三） 质粒pUC19的转化 质粒和感受态细胞混和：分别在100l感受态细胞悬液中加入下列DNA质粒或水，轻轻摇匀后冰上放置30分钟。 感受态细胞 + pUC19质粒 2l (10ng/ul.含量不超过50ng,体积不超过10l) 感受态细胞 +无菌水 2l （阴性对照）热击：42水浴中热击90秒（注：精确计算时间，过长将对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。 复苏：向每管中加入400l LB液体培养基(注：不含Amp),混匀后37轻摇培养11.5小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。,（四）涂布平板筛选转化质粒 将上述2管培养
13、液，分别取50ul、100ul涂布于含Amp的筛选平板上，其中阴性对照只取100ul涂布。（注：1. 将培养液摇匀后涂布；2.为了便于计算转化率，必须获得分散的、独立的菌落用于计数。所以涂布时尽量将50l的培养液均匀涂布于培养基的表面，使之尽量分散。）2. 正面向上放置15分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37培养过夜。（五） 次日（12-14小时后）观察和计算转化率 ：观察记录转化情况并统计转化率。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数该皿的菌落数稀释倍数 （注：稀释倍数 = 涂布前总体积涂板用菌液体积 ）
14、 转化频率转化子总数质粒DNA加入量(g) （注：理想值可达5106 2107转化子/ g DNA）,预期实验结果,实验报告（4）,计算转化率并根据转化率和阴性对照分析实验结果。思考题 (1). 根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？(2). 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？,实验中要考虑的重要因素,为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次继代或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来
15、控制。DH5菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。,2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。,
