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1、1,实验八、细菌鉴定中常用的一些生理生化反应,2,一、实验目的和内容,1、了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法；2、通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样性；3、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义；4、学习各种接种技术。,3,二、实验原理,各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。细菌的这种代谢特点可用于鉴别细菌。用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。,4,（一）大分子物质水解试验的实验原
2、理,微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解成小分子物质才能被微生物吸收利用。胞外酶主要是水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小的化合物，使其能被运输到细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程可以通过观察细菌菌落周围物质的变化来证实。如可以用滴加碘液到菌落周围看是否变蓝色来检查是否产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸会使培养基pH下降，可以在培养基中事先加入中性红试剂，培养基会从淡红色变为深红色。,5,（二）糖发酵试验的实验原理：略。（三）IMVIC试验的实验原理：略。 什么叫IM
3、VIC？ 1、吲哚试验的实验原理 2、甲基红试验的实验原理 3、V.P.试验的实验原理,二、实验原理,6,三、实验仪器、材料和用具,实验仪器37恒温培养箱。菌种大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌 等。试剂吲哚试剂、甲基红试剂、V.P.试剂。,7,三、实验仪器、材料和用具,培养基 平板：每个试验1 个平板/小组。 液体培养基：每个试验3支试管（2支接种，1支对照） /小组。实验用具 接种环、酒精灯、试管架、标签纸。,8,四、实验步骤和方法,实验共同步骤和方法： 配制培养基/倒平板（实验技术员准备） 标记：实验名称、菌种名称、组别 无菌操作转接菌种（教材 P.9-11：用接种环转接菌种到固体培
4、养基/液体培养基） 恒温培养：37，24h 观察、记录结果,9,1、淀粉水解实验,把淀粉平板培养基分成五部分，分别按下图方式接上提供的四种菌，留一区作为对照。（实验教材：P.113 1. （1）-（5） 图：淀粉水解实验接菌图,（一）大分子物质水解试验,10,2、油脂水解试验,实验教材：P.113 2. （1）-（5）接种方法：划线（蛇形线）接种。,（一）大分子物质水解试验,11,1、取3支葡萄糖发酵培养基，分别标明发酵培养基名称、所接种的菌名和组号。1支接种大肠杆菌；1支接种变形杆菌；第3支不接菌种，作为对照。2、另取3支乳糖发酵培养基，标记。1支接种大肠杆菌；1支接种变形杆菌；第3支不接菌
5、种，作为对照。3、接种后，轻轻摇动试管，使其均匀，并防止气泡进入倒置的德汉氏小管。4、将已接种好的培养基置37培养箱中培养24h。5、观察各培养基颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。*溴甲酚紫指示剂：pH 5.2(黄色)-6.8(紫色)。,（二）糖发酵试验,12,1、吲哚试验,实验教材： P.119 1. 接种与培养：（1）取3支胰蛋白水培养基培养基，1号接种大肠杆菌，2号接种产气杆菌，第3支不接菌种，作为对照。（2）37培养24h。 2.结果观察：（2）吲哚试验：略。,（三）IMVIC试验,13,2、甲基红试验,（1）取3支葡萄糖蛋白胨水培养基，标记。1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支不接
6、菌种，作为对照。（2）37培养 48h。（3）加甲基红指示剂数滴，观察结果。呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。*甲基红指示剂：pH 4.4(红色)-6.2(黄色)。,（三）IMVIC试验,14,3、V.P.试验,（1）取3支葡萄糖蛋白胨水培养基，1号接种大肠杆菌，2号接产气杆菌，第3支不接菌种，作为对照。（2）37培养 48h后。（3）加入40%KOH 510滴，然后再加入等量的5%-萘酚溶液，用力振荡，再放入37温箱中保温30min，以加快反应速度。（4）观察培养基的颜色变化。若培养物呈现红色，为伏-普反应阳性。,（三）IMVIC试验,15,硫化氢试验（不做）,取3支柠檬酸铁铵半固体培养基，采用穿刺接种的方法，1号接种大肠杆菌，2号接种变形杆菌，第3支不接菌种，作为对照。37培养24h观察结果。,16,柠檬酸盐利用试验（不做）,取3支柠檬酸钠斜面培养基， 1号接种大肠杆菌，2号接种产气杆菌，第3支不接菌种，作为对照。37培养24h观察结果。培养基变深蓝色者为阳 性。培养基不变色，则 继续培养57天，培养 基仍不变色者为阴性。,17,五、实验结果,（一）大分子物质的水解试验 实验教材： P.114 表-1,（二）糖发酵试验 实验教材： P.114 表-2,（三）IMVIC试验 实验教材： P.114 表-3,
