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1、细菌基因组DNA的提取,一、实验原理,1、核酸的分类,DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。,核酸制备的步骤：,细胞破碎 机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。DNA提取 SDS（十二烷基硫酸钠 ）法 ：SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间 常借静电引力或配位键
2、结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵 ）法 ：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。DNA纯化（去杂质） 蛋白质： 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA ：常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质： 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1PVP。,核酸提取的一般过程,核酸样品的保存温度： 4（5）最佳和最简单 -70是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20保存保存介质： TE缓冲溶
3、液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0,二、材料、设备及试剂,菌种 ：大肠杆菌DH5设备 ：eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器，水浴锅（ 37 、60 ）试剂：LB液体培养基 、无水乙醇、细菌基因组DNA提取试剂盒。,1、细菌 37 过夜培养，取1ml培养物 12000rpm 室温离心 1min。2、沉淀物加入180ul TE缓冲液，充分重悬细菌；再加入20ul 50mg/ml溶菌酶，混匀后于30温育10min。3、12000rpm 离心 5min, 弃上清后加入200 ul
4、 Buffer BTL，漩涡震荡悬浮细胞。4、加入25ul 蛋白酶K溶液，振荡器混匀，于55温育30min，每隔10min 漩涡震荡一次。5、加入220ul Buffer BDL，颠倒混匀，于65温育10min。6、加入220ul 无水乙醇，以最大速度漩涡震荡20s。7、转移样品至DNA 纯化柱中，纯化柱下端安装2ml收集管,12000rpm离心1min使DNA结合在纯化柱上，弃去收集管。8、将DNA纯化柱安装到新的2ml收集管中，加入500ul Buffer HB，12000rpm离心1min，弃去滤液。9、DNA纯化柱中加入700ul DNA Wash Buffer，12000rpm离心1min，弃去滤液。10、重复步骤9一次。12000rpm离心2min，干燥DNA纯化柱。11、将DNA纯化柱转移至1.5ml EP管中，加入50ul 预热（65）的Elution Buffer, 室温放置3min，12000rpm离心1min。,三、操作步骤,四、注意事项材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融,四、注意事项细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡,
