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1、医用分子生物学实验技术,青海大学医学硕士研究生课程,重组DNA技术操作步骤,基本原理,主要步骤： 制备目的基因和选择相关载体 目的基因和有关载体进行连接 重组的DNA导入受体细胞 DNA重组体的筛选和鉴定 DNA重组体的扩增、表达和其他研究,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,（三）PCR扩增特定基因,（四）人工合成,一、目的基因的获得分,（一）从基因组文库中获得,（二）从cDNA文库中获得,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,从基因组DNA
2、文库获取目的基因,用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库,从cDNA文库获取目的基因,化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,几种常用克隆载体的比较,注：+表示可用；-表示不可用,比较内容 质 粒 噬菌体 黏性质粒 M13噬菌体克隆容量 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb基因组DNA文库 - + + -cDNA文库 + + - -亚克隆 + - - +序列分析 + + - +E.coli表达 + + - -,二、载体的选择与准备选,三、DNA分子的体外连接接,（一）黏性末端,（二）人工接头的使用,（三）加入同聚体尾,（四）平端连接,（一）黏性末端
3、,（二）人工接头,（三）加入同聚体尾,待克隆DNA片段,重组质粒,混合、退火,空白质粒,（四）平端连接,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5 3 T(T)nT,T(T)nT 35,3 A(A)nA,A(A)nA,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶+ dATP,末端转移酶+ dTTP,5,35,四、外源DNA导入宿主细胞转,受体菌条件：安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式：转化 (transformation)转染 (transfection)感染 (infection),外源基因导入宿主细胞后，筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。 所用的
4、方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。,五、目的基因的筛选和鉴定筛,1. 借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选(2) 利用基因的插入失活/插入表达 特性筛选(3) 利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选,2. 序列特异性筛选 (1) RE酶切法 (2) PCR法 (3) 核酸杂交法(4) DNA测序法,（一） 遗传学方法,1. 插入灭活法,插入失活筛选带有重组载体的克隆,2. 蓝-白筛选（互补）,许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了
5、一个多克隆位点。这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有活性的-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。,互补筛选（蓝-白筛选）,PCR产物的T载体克隆和转化,实验目的： 学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。实验要求： 掌握利用T载体克隆PCR产物的方法；复习连接实验流程。技术应用： 目的基因片段与T载体DNA连接，达到克隆基因的目的。,材料：目的基因片段（回收的PCR产物）药
6、品：pEMG T-Vector (Promega公司),质粒（plasmid） 是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数千碱基对。常 有1 3个抗药 性基因，以利于 筛选。,质粒载体,克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。,实验原理,普通Taq酶会在3末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3端均有一个单链状态的A；T-载体是线状DNA片段，在DNA双链的3端均有一个单链状态的T；二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。,载体结构的三大要素： 多克隆位点
7、 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位,GEM-T 载体的结构,GEM-T Easy 载体的结构,实验步骤,（1）目的片段的制备-胶回收法回收PCR产物：,(2)连接实验： 在0.2ml PCR管加入以下试剂： 目的片段（100ng/ul） 3l pGEM-T Easy（50ng/ul） 1l T4 DNA Ligase 1l 2Rapid Ligation Buffer 5l Total 10 L 备注：混合均匀，瞬时离心。 4连接16小时，-20储存或直接用于转化。,说 明,1.回收DNA片段可以用沉淀法，但是只适用于PCR扩增产物为单一片段，而且需要检测PCR扩增结果后进行；2.此种连接方法是根据普通Taq酶会在3末端加一个A的原理发明的；注意不同的酶的性能不同，保真性强的Taq酶会自动切除末端的A，所以，这种酶的扩增产物需要补加A后再连接。3.T-载体的阳性克隆筛选同样可以使用“蓝白斑”法，方便，快捷。,
