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1、利用小鼠动物模型研究基因表达与病理发育,郑耀武转基因动物实验中心综合实验楼85098583,转基因动物技术原理与应用,第一部分：常规转基因技术原理第二部分：基因定位修饰技术原理第三部分：CRISPR/Cas9技术原理与应用,第一部分,常规转基因动物原理与应用,什么是转基因？,狭义：人为将DNA片段插入基因组广义：人为的对生物基因组的修饰，包括随机的基因片段插入，基因定位敲除，基因定位敲入，基因定点突变等,动物转基因的重要性,基础理论研究 （小鼠）研究基因调节，包括启动子功能基因功能追踪（Knockout，Gene Trap）细胞追踪，如癌细胞转移（如EGFP基因敲入）基因表达与胚胎发育，器官发
2、育基因表达与生物学功能、病理发育基因突变体表达功能研究基因相互作用应用研究 （大动物）生产活性蛋白：酶，疫苗，抗体，生长因子，蛋白药（蛋白活性要求特异的翻译后修饰）低生产成本：转基因动物可以传代，可以连续生产，如血浆蛋白，乳蛋白，比细胞培养成本低病理动物模型，利用动物模型研究疾病发生机理、药效测试器官移植：解决器官不足，重复感染问题，如猪肝脏品种改良(GMO)：抗病，高产，营养价值提升疾病治疗：治疗遗传缺陷，组织再生,转基因技术研究历史,第一个转基因小鼠：1974年第一个小鼠干细胞：1981年第一个基因捕获小鼠：1989年第一个基因敲除小鼠：1997年第一个克隆动物：2008年第一个CRISP
3、R/CAS9小鼠,Rudolf Jaenisch in 1974. Jaenish successfully managed to insert foreign DNA into early-stage mouse embryo resulting mice carried modified gene in all their tissues and progeny.,Gossler, A., A. L. Joyner, et al. (1989). Mouse embryonic stem cells and reporter constructs to detect development
4、ally regulated genes. Science 244(4903): 463-5.,Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from ealry mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci (USA). 1981;78:7634-8.,Hooper M, Hardy K, Handyside A, Hunter S, Monk M. HPRT-deficient (Lesch-Nyh
5、an) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 1987;326:292-5.,Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F.Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23. doi: 10.1126/
6、science.1231143. Epub 2013 Jan 3.,Dolly (5 July 1996 14 February 2003) was a female domestic sheep, and the first mammal to be cloned from an adult somatic cell, using the process of nuclear transfer.,常见转基因技术,常规方法 ：受精卵细胞核DNA显微注射，随机插入，预见性低，但多样性利用精子转染DNA，效率低，重复性差利用转坐子进行DNA在基因组的插入，方法复杂，受限多病毒感染：效率高，随机性低
7、，可带DNA大小受限制，安全隐患，常用于大动物干细胞胚胎显微注射：常用于小鼠基因定位修饰，预见性高，费时，大动物不成功核移植动物克隆：大动物基因定位修饰唯一途径CRISPR/Cas9技术：最新发展的，快速、简便、高效基因组修饰技术,真核基因结构与调节,真核基因结构（cis element)：启动子(promoter)，外显子(exon)，内含子(intron)，polyA信号, 活化信号（enhancers), 沉默信号（silencers），封闭区(Insulators)转录因子(trans element)(transcription factors)，活化因子(activators)，抑
8、制因子(inhibitors)真核mRNA结构：Cap，5非编码区(5-UT)，编码区(coding region)，3非编码区(3-UT)，polyA组织专一性调节(tissue-specific regulation, spatial)发育阶段调节(developmental regulation, timingly)诱导性调节(inducible)转录后调节: mRNA剪接和修饰， mRNA的稳定性，蛋白质合成效率，蛋白质半衰期,基因结构图示,mRNA结构,基因转录复合体,转基因载体构建,启动子选取cDNA 选取Poly A 选用内含子和封闭区载体构建,启动子的类型和选取,特异启动子：研
9、究基因调节（lacZ），启动子功能，调节其它基因表达。用于其它基因表达，一定要查询启动子在转基因动物应用文献，了解启动子完整性高表达启动子选用：用于高表达某个基因，高表达蛋白生产广谱启动子应用：显示基因细胞标记（EGFP）可诱导启动子的应用：用于基因调节，有毒蛋白表达，致命基因的调控复合启动子：可诱导、高表达、组织专一基因调节系统，用于调节基因或高表达蛋白,表达基因（cDNA）的类别,显示基因(reporters): lacZ, GFP, CAT, AP等 调节基因: Cre, ER-Cre, tTA, tTR,PTX等蛋白质功能研究：蛋白突变体的表达基因剪接：研究外显子、内含子功能商业基因：
10、药用蛋白，改良基因等 生理功能基因: 基因治疗，干细胞移植等非编码基因：非编码RNA功能研究，siRNA基因沉默, CRISPR/Cas9 gRNA基因组修饰抗性基因：细胞筛选,其它转基因载体构件选取,oly A ：提供稳定的mRNA常用poly A: SV40 poly A, -Globin poly A内含子选用：第一个内含子，如-Globin 内含子封闭区应用：增加表达几率，减少对周围或被周围基因影响Loxp, FRT, tetO序列,基因A启动子,典型转基因结构（Heterologous）,CCAAT box,TATA box,Enhancer,转录起始点,基因B cDNA,翻译起始点
11、,基因C polyA,5-UT,3-UT,拼接区域：,转基因动物（Founders）鉴定,检测转基因在基因组插入：PCRSouthern拷贝数：Southern, Real time PCR插入位点：Inverse PCRmRNA表达：In SituRT-PCRNorthern蛋白表达：显示基因：酶活性分析lacZ，Luciferase，AP, 荧光EGFP, RFP功能分析：结构变化：石蜡切片，H&E染色免疫组织化学、免疫荧光定位：冰冻切片，抗体染色免疫沉淀：Western,小鼠生物学基础及转基因优越性,小鼠免疫力强，繁殖率高，体型小，为经济有效动物模型小鼠遗传表型多样，全基因组序列解析，经
12、典哺乳类实验动物模型多种自交系孕期1921天性成熟时间：母45周，雄5-6周母鼠发情周期5天左右成鼠体重：20-50克母鼠平均产子56窝，自交系每窝6-8只，远交系10-14只,产生转基因鼠标准条件和要求,洁净动物房，高蛋白，高脂肪饲料（Breeder chows) 供卵鼠：4-6周杂交子一代母鼠(C57B6xCBA or DBA),每次10-12只，每周两次种鼠：年龄两月到一年的杂交子一代雄鼠(C57B6xCBA or DBA) 20-24只代孕母鼠：每次见栓2-5只，2-6月高繁殖率母鼠(CD1)50-100只结扎公鼠： (C57B6xCBA or DBA)子一代或 (CD1)雄鼠，各需求
13、10-20只，适用年龄2-18月,转基因小鼠具体操作过程,构建载体，纯化DNA片段，去除原核载体序列促排卵激素超排卵，合笼，分离E0.5 受精卵DNA显微注射胚胎培养过夜胚胎回移代孕鼠切尾鉴定传代杂交表达分析,性成熟,供体受精卵收集，每次100200个 供体受精卵细胞核DNA显微注射浓度: 2-5ng/ul 受精卵回移代孕母鼠: 每只移植20-30个左右双细胞卵 PCR或Southern 筛选转基因鼠(founders), 15-50%, 随机插入，拷贝数1-100 第一代下传（F1) 0-100%，有卵裂后插入或两个以上的插入位点 第二带下传，蒙德尔遗传，50 表达功能分析：从E10到5个月
14、,转基因鼠产生相关的数据,转基因常见问题,启动子不完整，造成基因不表达或错误表达DNA插入随机性造成不表达、低表达、鼠系间差异封闭区(insulaters)序列基因高表达毒性，得不到转基因鼠或不表达第一个内含子重要性转基因片段的大小：2kb到1000kb 大部分2-10kb,容易注射P1质粒(PAC),70kb左右，黏度大细菌人工染色体BAC，120kb左右， 黏度更大酵母人工染色体YAC，500kb-1000kb，非常难注射同时注射两个以上的转基因：效率高，一般插入同一位点多拷贝插入方式：头尾相接拷贝数与表达水平：无紧密关联，多数拷贝被甲基化，转录因子浓度限制其它因素：DNA浓度(2-3ng
15、/ul)，酒精、嗅化乙锭和EDTA残留载体骨架DNA对转基因表达影响：原核序列不稳定 C57/BL6纯系转基因鼠受精卵注射：效率略低,转基因动物原理及应用,第一部分：常规动物转基因技术原理第二部分：基因定位修饰技术原理第三部分：CRISPR/Cas9技术原理与应用,第二部分：基因定位修饰,基因定位修饰原理基因定位修饰过程基因定位修饰应用,基因定位修饰重要性,基因功能研究：随着基因组解析，基因敲除和基因定位修饰进行基因功能解析基因调节：可以人为控制基因位点准确修饰，基因调节更为精确，研究结果更确定，病理模型更有价值基因修饰稳定性，低拷贝，对基因组影响小，表达特定蛋白，大动物克隆，抗体基因组置换基
16、因治疗：准确定位修饰，结合人类干细胞培养和CRISPR/Cas9技术，是将来基因治疗(Gene Therapy)、组织再生(Regeneration Medicine) 重要途径,小鼠早期发育示意图,3.5天,干细胞特性,祖细胞 (projenitor cells)的特性可以分化成少数不同种类细胞的原性细胞，可以进行有限次数的不等分裂干细胞(stem cell)的特性可以分化成多种组织器官、不断增殖的少数细胞胚胎干细胞(ES)具有全能性每个细胞可以发育分化成任何组织器官、个体小鼠胚胎干细胞来源：囊胚内细胞群(ICM)来源种系：多数129SV/jae, 少数 C57/BL6 毛色：棕色(129)
17、, 黑色(C57/BL6)性别：雄性干细胞更稳定,Gene Trap (基因捕获）,源于小鼠干细胞全能性的发现标示基因高通量小鼠基因组随机插入，基因分析利用无启动子标示基因表达框，前端有内含子/外显子剪接信号，后面有PolyA，中间有抗性基因随机插入内含子后会剪接成融合表达蛋白，标示基因表达原基因位点失活公数据共平台库： International Gene Trap Consortium is centralizing data and cell lines can be requested from them.,基因定位修饰载体类型,简单基因敲除载体构建原理条件性敲除载体构建原理点突变显示
18、基因敲入组织专一基因位点敲入（LacZ, EGFP），研究基因表达广谱loxp敲入，与调节基因Cre结合，进行组织特异性敲除,NEO,1,3,TK,X,X,1,NEO,3,载体,重组后,基因敲除载体设计原理,NEO,TK,FRT,FRT,loxP,loxP,野生型,载体,用Flipase去NEO,FRT,CRE杂交失活基因,loxP,FRT,条件性敲除载体构建原理,Gene targeting in embryonic stem cells has become the principal technology for manipulation of the mouse genome, off
19、ering unrivalled accuracy in allele design and access to conditional mutagenesis. To bring these advantages to the wider research community, large-scale mouse knockout programmes are producing a permanent resource of targetedmutations in all protein-coding genes. Here we report the establishment of
20、a high-throughput gene-targeting pipeline for the generation of reporter-tagged, conditional alleles. Computational allele design, 96-well modular vector construction and high-efficiency gene-targeting strategies have been combined to mutate genes on an unprecedented scale. So far, more than 12,000
21、vectors and 9,000 conditional targeted alleles have been produced in highlygermline-competent C57BL/6N embryonic stem cells. High-throughput genome engineering highlighted by this study is broadly applicable to rat and human stem cells and provides a foundation for future genome-wide efforts aimed a
22、t deciphering the function of all genes encoded by the mammalian genome.,基因定位修饰过程,干细胞分离、培养，多用固定细胞系基因定位修饰载体构建干细胞转染和重组克隆筛选干细胞囊胚显微注射嵌合体产生与传代杂合体产生纯合体产生基因功能的分析,利用小鼠干细胞进行基因打靶过程,嵌合体的传代杂交,嵌合体（Founders） ES 均来源于129 鼠系，为棕色 (agouti) C57BL6 囊胚为黑色(black) ES注入后，毛色可以预测干细胞并入比例40-100%雄性嵌合体与C57/BL6母鼠交配 6周左右与两只 C57 母鼠杂
23、交，每周换一次母鼠棕色为显性，如果连续六窝全黑，放弃嵌合鼠,输卵管移植,子宫移植,代孕鼠,电击筛选,囊胚注射,转基因和基因定位修饰过程的比较,Founder的产生,传代，分析,受精卵细胞显微核注射,转基因与基因打靶比较,第三部分,基因定位修饰进展CRISPR/Cas9技术原理利用CRISPR/Cas9技术研究生理、病理发育,DNA随机突变（化学诱变，放射线诱变）转基因技术（DNA片段基因组随机插入）小鼠全能干细胞发现和应用（基因捕获）基因打靶（DNA重组基因定位修饰）锌指核酸酶ZNF（基因组定位切割修饰）TALEN（基因组定位切割修饰）CRIPSR-Cas9（基因组定位切割修饰）,基因组修饰历
24、史,利用ZFN 技术进行基因组修饰,2000早期，研究者开发了锌指核酸酶（ZFN）技术, 首次利用人工构建DNA序列特异核酸酶，对基因组进行识别、切割和修饰锌指酶发源于转录因子结构，类似于转录因子，具有两个结构域：人工设计DNA-binding zinc-finger protein (ZFP) domainFokI DNA nuclease domainDNA识别域由3-6个Cys2-His2锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白区结合3-5方向DNA链上特异三联体碱基以及5-3方向的一个碱基ZFN以二聚体结合到靶位点上，相距5-7个碱基，通过两个FokI核酸酶切割靶位点由于信息有限，设计复杂，有多
25、达60种的锌指库，设计完美的锌指核酸酶要花费很长时间,ZFN工作原理,利用TALEN技术进行基因组修饰,Transcription activator-like effector nucleases (TALENs),TALENs 同样包括两个结构域，一个是DNA Binding，另一个是 FokI nuclease Transcription activator-like effectors (TALEs) 为3335 amino acid repeats,每一个repeat识别一个碱基对，由中间的第12和13氨基酸决定，称为 repeat variable diresidues (RVDs
26、). 最常用的四组为 Asn-Asn, Asn-Ile, His-Asp and Asn-Gly，分别识别 G, A, C 和T四个碱基。,TALEN 工作原理,CRISPR/Cas9 发现与应用进展,最初发现于bacteria or archaea，由protospacers 和 direct repeat 序列顺序排列，可以转录成crRNA 和 tracrRNA两种小RNA。Protospacers，DNA fragments (20 bp)，来源于噬菌体或质粒，相间于direct repeat，统称为 CRISPR。两个小RNA与CRISPR-associated protein 9 (
27、Cas9)一起，具有 DNA特异序列 endonuclease活性，识别和切割外源DNA、RNA，行使免疫保护功能。crRNA and tracrRNA 可以通过DNA转录成single-chain guide RNA (sgRNA)，同样具有CRISPR功能。,Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR),CRISPRCas9工作原理,常用表达系统Available Expression Cassette,常用质粒px330,PAM 序列出现频率,设计简单效率高特异性强一次性多位点修饰适用于各种生物用途广,
28、CRISPRCas9系统优势,CRISPRCas9技术应用,Cas9蛋白和导向RNA共转染人细胞基因组修饰1）核定位Cas9 蛋白2）U6启动子带动的一个或多个导向RNA3）导向RNA紧跟着正确的PAM序列4）任何GN20NGG均可为靶点,3 gene, 6 locus targeting efficiency,Nickase 工作原理,Cas9突变，细菌筛选不同PAM序列增加了特异性发现更多的Cas9变异型具有更好的特异性发现更小的Cas9变异型说明还有挖掘潜力和改进的空间,Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71. doi: 10.1016/j.cell.2015.0
29、9.038. Epub 2015 Sep 25.Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System.Zetsche B1, Gootenberg JS2, Abudayyeh OO3, Slaymaker IM3, Makarova KS4, Essletzbichler P3, Volz SE3, Joung J3, van der Oost J5, Regev A6, Koonin EV4, Zhang F7.AbstractThe microbial adaptive immune system
30、CRISPR mediates defense against foreign genetic elements through two classes of RNA-guided nuclease effectors. Class 1 effectors utilize multi-protein complexes, whereas class 2 effectors rely on single-component effector proteins such as the well-characterized Cas9. Here, we report characterization
31、 of Cpf1, a putative class 2 CRISPR effector. We demonstrate that Cpf1 mediates robust DNA interference with features distinct from Cas9. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease lacking tracrRNA, and it utilizes a T-rich protospacer-adjacent motif. Moreover, Cpf1 cleaves DNA via a staggered DNA dou
32、ble-stranded break. Out of 16 Cpf1-family proteins, we identified two candidate enzymes from Acidaminococcus and Lachnospiraceae, with efficient genome-editing activity in human cells. Identifying this mechanism of interference broadens our understanding of CRISPR-Cas systems and advances their geno
33、me editing applications.,Feng Zhang labs Target FinderIdentifies gRNA target sequences from an input sequence and checks for off-target binding. Currently supports: Drosophila, Arabidopsis, zebrafish, C. elegans, mouse, human, rat, rabbit, pig, possum, chicken, dog, mosquito, and stickleback.Michael
34、 Boutros labs Target Finder (E-CRISP)Identifies gRNA target sequences from an input sequence and checks for off-target binding. Currently supports: Drosophila, Arabidopsis, zebrafish, C. elegans , mouse, human, rat, yeast, frog, Brachypodium distachyon, Oryza sativa, Oryzias latipesRGEN Tools: Cas-O
35、FFinderIdentifies gRNA target sequences from an input sequence and checks for off-target binding. Currently supports: Drosophila, Arabidopsis, zebrafish, C. elegans , mouse, human, rat, cow, dog, pig, Thale cress, rice (Oryza sativa), tomato, corn, monkey (macaca mulatta).CasFinder: Flexible algorit
36、hm for identifying specific Cas9 targets in genomes Identifies gRNA target sequences from an input sequence, checks for off-target binding and can work for S. pyogenes, S. thermophilus or N. meningitidis Cas9 PAMs. Currently supports: mouse and human.,gRNA 免费设计软件网站,ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9总结比较,利用Crispr
37、-Cas9技术建立自闭症小鼠模型,直接敲除模型LacZ敲入模型,Dip2A为自闭症潜在相关基因之一,Poelmans, G., et al. (2009). Identification of novel dyslexia candidate genes through the analysis of a chromosomal deletion. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 150B(1): 140-147.,Dip2A基因组序列缺失的阅读障碍家系,成功敲除整个基因（65Kb ）受精卵注射敲除效率： 23.1% 干细胞打靶敲除效率： 39%,利
38、用CRISPR-Cas9系统进行Dip2A-LacZ敲入模型,Dip2A LacZ Knock-in,胚胎发育期Dip2A表达分析,成年期Dip2A脑部表达分析,系统进一步优化，PAM序列多样化高通量基因序列功能分析Inducible Cas9 mouse重复序列功能分析人类疾病动物模型器官移植，免疫排斥基因的敲除品种改良药物开发动物抗体基因人源化基因治疗遗传缺陷修复基因表达水平校正,基因组修饰前景,思考题,简述常规动物转基因原理和方法简述基因定位修饰原理简述基因定位修饰类型和方法简述常规转基因和基因定位修饰的不同及各自的优越性简述CRISPR/Cas9技术原理简述CRISPR/Cas9技术可应用范围,
