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1、,蛋白质晶体学,一、几何晶体学,1.点阵结构及晶胞,(1)点阵结构定义： 任何能为平移复原的结构称点阵结构。能使一点阵结构复原的全部平移形成一个平移群 ua+vb+wc，称为该结构的平移群。u，v，w 为整数，a，b，c 为三个非共面的向量。 点阵结构与其相应的平移群必存在下列关系： (1)从点阵结构中某一点指向点阵结构中的每一点的向量都在平移群中。 (2)以点阵结构中任一点为起点时，平移群中每一个向量都指向结构中一个点。,晶体的点阵结构,点阵分类：分布在同一直线上的叫直线点阵;分布在同一平面的叫平面点阵；分布在三维空间的叫空间点阵。,晶胞和晶格,从一个空间点阵结构中一定可以划出一个平行六面体
2、，这一平行六面体称为晶胞。晶胞由晶体空间点阵中3个不共面的单位矢量a，b，c所规定，其大小形状用晶胞参数a，b，c，,表示。空间点阵按照确定的平行六面体单位划分后，称为晶格。,晶格中的一个晶胞,晶格是晶胞在三维空间中的堆积,晶面指标,晶体的空间点阵可划分为一组平行而等间距的平面点阵。晶体外形中每个晶面都和一组平面点阵平行，可根据晶面和晶轴相互间的取向关系，用晶面指标标记同一晶体内不同方向的平面点阵族或晶体外形的晶面。,晶面指标,设有一平面点阵和3个坐标轴x,y,z相交，在3个坐标轴上的截数分别为r,s,t（以a,b,c为单位的截距数目）截数之比即可反映出平面点阵的方向。但直接由截数之比r：s：
3、t表示时，当平面点阵和某一坐标轴平行，截数将出现，为了避免数，规定用截数的倒数之比1r:1s:1t作平面点阵的指标。由于点阵的特性，这个比值一定可化成互质的整数之比1r:1s:1th:k:l,所以平面点阵的取向就用指标（hkl）表示。,r：s：t=3:3:5,1r:1s:1t=1/3:1/3:1/5 =5:5:3,晶面指标,由平面（100），（010），（001）围成的单个晶胞。用100,010和001表示a、b、c三个方向。,实际晶体中的几个晶面。,晶面交角不变定理,2.最基本的对称元素,点阵结构是很有规律的结构，除了上述的平移群能使它复原外，还存在另外一些能使其复原的对称元素，如对称中心（
4、倒反），镜面，旋转轴，旋转反轴，空间点阵结构中只能容纳有限的几种旋转轴，即二重轴、三重轴、四重轴及六重轴，所以其最基本的对称元素只有七种。,旋转操作n旋转轴Ln,以一个假想直线为轴，绕此直线旋转一定的角度可使图形相同部分重合。直线称为对称轴，以L表示，分为n重旋转轴，其中n360/, 为旋转角度。受点阵结构的限制，晶体中只存在1，2，3，4，6几种旋转轴，用L1， L2 ，L3， L4， L6 表示。,旋转轴 1.2.3.4.6重轴,1,6,2,3,4,镜面m和倒反操作i,镜面：镜像关系 倒反：类似于相机（凸透镜）等大成像,旋转反演操作反轴Lin,旋转倒反,i,m,3i,3m,基本对称元素名称
5、，矩阵表达式及其等效点表,名称 符号 矩阵表达式 等效点(1) 对称中心 i -1 0 0 X -X 0 -1 0 Y -Y 0 0 -1 Z -Z(2) 镜面 m 1 0 0 X X 0 -1 0 Y -Y 0 0 1 Z Z(3) 二重轴 2 -1 0 0 X -X 0 1 0 Y Y 0 0 -1 Z -Z(4) 三重轴 3 0 -1 0 X -Y Y-X 1 -1 0 Y X-Y -X 0 0 1 Z Z Z(5) 四重轴 4 0 -1 0 X -Y -X Y 1 0 0 Y X -Y -X 0 0 1 Z Z Z Z(6) 四重反轴 4 0 1 0 X Y -X -Y -1 0 0
6、Y -X -Y X 0 0 -1 Z -Z Z -Z(7) 六重轴 6 0 1 0 X Y Y-X -X -Y X-Y -1 1 0 Y Y-X -X -Y X-Y X 0 0 1 Z Z Z Z Z Z,3.七个晶系,根据晶胞形状，也就是六个晶胞参数，以及晶胞中所容纳的特征对称元素，可以把不同的晶胞分成七个类型，即七个晶系。晶胞参数的特征是各个晶系的宏观表现，是区分七个不同晶系的必要条件但不是充分的条件，只有特征对称元素是区分晶系的关键所在。,七个晶系及其特征对称元素,晶系 特征对称元素 晶胞参数对称元素方向立方 4个按立方体的对角线 abca a+b+c a+b 取向的三重轴 90六方 六
7、重轴（平行于C轴） abc c a 2ab 或六重反轴 90 120四方 四重轴（平行于C轴） abc c a ab 或四重反轴 =90三方 三重轴（平行于C轴， abcc a 按六方取）或三重 90 反轴 120 正交 二个互相垂直的对称 abca b c 面或三个互相垂直的 90 二重轴单斜 一个二重轴或对称面 abcb 90 三斜 无或仅有一个对称中心 abc ,4.32个点群,两个对称元素的结合就会产生新的对称元素，在七个晶系中把特征对称元素与基本对称元素进行组合，就会产生32种不同的对称元素组合，这就是32个点群。,二重轴和镜面对称元素的结合1.两个相交的二重轴必在它的垂直方向产生第
8、三个旋转轴。新轴的基转角是两个相交二重轴夹角的两倍，即2。由于晶体学中只有2，3，4，6重轴，因此只能是30，45，60，90。2.两个镜面相交，其交线是一旋转轴，旋转轴的基转角是两个相交镜面夹角的2倍。所以也只能是30，45，60，90。3.二重轴与垂直它的镜面结合，其交点是一对称中心。,5.14个布拉菲格子,有时为了获得较高的对称性，把原有晶胞扩大，使成为带心的晶胞，由此在七个晶系中可以得到14种不同的布拉菲格子，不带心的晶胞称为素晶胞（P），带心的称为复晶胞（I，F，C）。,素晶胞（简单晶胞）和复晶胞,素晶胞,带底心的晶胞,在选取复杂点阵时，除了平行六面体的顶点外，只能在体心或面心有附加
9、阵点，否则将违背空间点阵的周期性，所以只能出现这四类晶胞。,简单三斜aP简单单斜mP底心单斜mC(mA,mB) 简单正交oPC心正交oC(oA.oB)体心正交oI面心正交oF,Bravais lattice：,R心六方hR 棱方hP简单四方tP体心四方tI简单立方cP体心立方cI面心立方cF,可以发现，除了在正交 晶系中四类晶胞可同时出现外，在其他晶系中由于受到对称性的限制或是不同类型阵点可相互转换的缘故，都不能同时出现。如：立方晶系中，底心点阵与该晶系的对称性不符（在4个按立方体对角线排列的方向上有三重轴），所以不能存在。,6.230个空间群,对称元素和平移向量相结合，可以得到一类含有平移的
10、新的对称元素，即螺旋轴和滑移面。 旋转轴和平移向量结合得到螺旋轴 对称面与平移向量结合得到滑移面 各种对称元素的符号图示 把所有类型的对称元素与32个点群、14个布拉菲格子，按照一定规则的组合就可得到230个空间群。,螺旋旋转操作螺旋轴nm,旋转平移,螺旋旋转操作螺旋轴nm,旋转平移（n为轴次，m为滑移量，mn）,图：三重轴（左）和三重螺转轴（右）；后者通过将一个分子旋转120后再平移半个晶胞距离与另一个分子相关联。,31,11种螺旋轴2131，3241，42，4361，62，63，64，65,反映滑移操作滑移面g,反映平移,5种滑移面a,b,c,n,d,空间群的记号及其意义P1 C2 P21
11、2121 I4122 R3 P6122 P23第一个字母表示Bravias格子类型，接着是对称元素的记号，对称元素所在的位置表示该对称元素在相应晶系中的方向。,如何从空间群（Space group）记号知道晶系：1.如果在第一位出现高次轴（3、3、4、4、6、6）就相应于三方、四方、六方晶系2.如果只有一个方向有对称元素且不是高次轴则()有2或21轴或镜面滑移面的是单斜晶系()仅有i或无对称元素的是三斜晶系3.如果三个方向都有对称元素且仅仅是2，21镜面或滑移面的则是正交晶系4.如果在第二位方向上有3或3的则是立方晶系,不对称单位由于晶胞中有对称元素，所以不是整个晶胞内对象都是独立的，晶胞中最
12、基本的独立单元叫不对称单位。不对称单位内的所有对象通过晶胞所具有的对称元素的操作可得到整个晶胞所包含的对象。一个晶胞可以有多种不同形状的不对称单位，但它们的体积是相等的，等于晶胞体积除以等效点数,二、X射线晶体学,Bragg定律,Bragg定律晶体对X-射线的衍射可以看成晶体中原子平面对X-射线的反射。在同一晶面中所有原子的反射线的相位是相同的，与该晶面平行的一组平面上的原子，要满足Bragg方程时才有相同相位的反射。2dhklsin =n图,2dhklsin =n对某一晶体来说dhkl是确定不变的，当一定时只有特定的值才能满足以上方程，也就是说只有晶体处于某一方位时才能产生衍射。,1.倒易点
13、阵,倒易点阵简便而又形象地说就是衍射照片上的一组点，晶胞（又称正空间）中的点用XYZ来表示，倒易点阵（又称倒易空间）中的点用HKL来表示。 X射线晶体学处理倒易点阵的对称性。,2.11个劳埃群,在倒易点阵的对称性中，几何晶体学中的七个晶系和基本对称元素都不变，在不考虑反常散射效应的情况下，晶体衍射对称性均较原晶体的几何晶体学对称性多一个对称中心，这样使几何晶体学中的32个点群变成X射线晶体学中的11个Laue群。,3.120个衍射群,几何晶体学中带有平移向量的对称元素即螺旋轴、滑移面，会使衍射照片中的特定的点的强度为零，也就是说这些衍射点，在照片中消失了，称为系统消光。 复晶胞也就是带心的Br
14、avais格子，也会使一些特定的点强度为零，产生系统消光。 通过系统消光规律的辨识，就可知道几何晶体学中的230个空间群。遗憾的是，不是所有的空间群都能通过系统消光规律的辨识来唯一确定，通过衍射试验只能把230个空间群分成120个不同的衍射群，也就是说同一个衍射群有可能对应于几个空间群。,system absence of lattic type condition Bravie lattic all hkl 1. h+k+l=2n I 2. h+k=2n h,k,l h+l=2n or all odd F k+l=2n all even 3. h+k=2n C (h+l=2n) (B) (k
15、+l=2n) (A) 4. -h+k+l+3n R,system absence of screw axis h00 h=2n 21,42 h00 h=4n 41,43 0k0 k=2n 21,42 0k0 k=4n 41,43 00l l=2n 21,42,63 00l l=3n 31,32,62,64 00l l=6n 61,65,三、晶体结构测定,1.相角问题,从晶体X衍射图的形状及对称性可以推算晶胞的大小和空间群（可能不是唯一的）。用X衍射方法解晶体结构就是要进一步知道晶胞中原子的分布也就是原子坐标。,根据上述公式只要知道每一衍射点的|Fhkl|和(hkl)就可算出晶胞中每一点的电子密
16、度，从中就可得到原子坐标。在衍射实验中每一衍射点的实验强度信息可以记录，由此可以推出|Fhkl|，但每一衍射点的相角信息(hkl)却丢失了。因此解晶体结构的关键是相角问题，有了相角，原子坐标就迎刃而解了。,2.Patterson法(1)Patterson函数,其意义是晶胞中相距为向量(uvw)二点的电子密度乘积的平均，显然如果两个原子间的距离正好是向量(uvw)，那么它的p(uvw)值最大，所以Patterson函数图上的峰反映了原子间的向量，由于计算p(uvw)时没有相角问题，有了实验测得的强度就可以算。问题是如何从(uvw)峰得到原子坐标。,(2)Patterson峰的特性,A.峰的数目
17、N(N-1)+1。B.峰的高度 与两个原子的原子序数ZiZj成正比。C.对称性总具有对称中心 i，对称元素的平移部分消失即螺旋轴、滑移面变成旋转轴、镜面，所以只有24种类型（11 Laue群加上各个 Laue群可能的格子类型）。D.Harker截面，Harker峰。等效点之间的向量峰，称Harker峰，Harker峰所在的平面，称Harker截面。由旋转轴联系的两个原子向量峰一定落在一个特殊的Harker截面，由镜面、滑移面联系的两个原子向量峰一定落在一条特殊的线上。,3)Patterson法解结构一般步骤,A.测定晶胞参数及空间群B.测定晶胞中分子数 n（根据晶体密度计算或估计）C.根据空间
18、群的等效点列出Patterson峰表Harker峰D.计算 Patterson 函数（矢量图）E.根据峰表解出重原子坐标F.由重原子(或已知坐标的原子)计算相角和电子密度图G.从电子密度图找出未知原子的坐标H.重复 F.G. 直到找出全部原子坐标I.结构修正,3.直接法简介,我们说从衍射实验中，强度信息可以记录，相角信息丢失了，但我们仅仅从衍射强度最终又可得到原子坐标，说明实际相角没有真正的丢失，只是不能像强度那样直接记录，变成显而易见的，它是隐含在强度信息之中的，因此选择一些较强的衍射点，通过这些衍射点之间的相角关系信息，最终导出这些衍射点的相角，然而用这些衍射点计算E图（类似于电子密度图）
19、，就可以得到某些原子的坐标信息，利用这些原子坐标可以计算所有衍射点的初步相角及电子密度图，最终解出全部结构。,四、蛋白质晶体学,4.1 蛋白质分子与小分子差别,(1)蛋白质分子大多是C、H、O、N、S组成，少数有金属离子如Cu、Zn等，因此，想用 Patterson 法来解大分子结构要在晶体中引入定位的重原子。(2)组成蛋白质大分子的单个氨基酸有不对称碳原子，而蛋白分子中又只有L型氨基酸，因此蛋白质晶体的对称元素只有对称轴，而没有 m、i。这样230空间群，在蛋白质晶体中只有65种仅含对称轴的空间群。(3)蛋白质分子分子量较大，因此，不能用简单的重原子的相角代替全体原子贡献的相角。,4.2蛋白
20、质晶体结构测定基本步骤,1结晶2数据收集与处理3相角测定4相角改进5电子密度计算和解释6修正,4.3结晶4.3.1结晶过程相图,4.3.2影响结晶的因素,蛋白质纯度,微观均匀性. 蛋白质浓度沉淀剂浓度 (NH4)2SO4，各种分子量的PEG、 MPD (二甲基2,4戊烷二醇). 影响有效浓度添加剂 去污剂、金属离子、还原剂 DTT， 针对蛋白本身性能pH 缓冲液类型 有机缓冲液现更常用，磷酸缓冲液易生成磷酸盐。影响残基的解离常数离子强度 影响静电相互作用 盐析盐溶也是影响有效浓度温度 一般不敏感生复合物晶体 抑制剂、辅因子、底物、Fab片段截去柔性过大的C端或N端，以甘油作辅助溶剂长突变体蛋白
21、 如何选择突变位点是关键,4.3.3结晶方法,最常用的气相扩散法(悬滴、坐滴)，平衡透析法,4.4数据收集与处理4.4.1历史发展,4.4.2数据收集时考虑的参数,晶体到探测器的距离：晶胞越大该距离应加大，以免衍射点重叠。分辨率：晶体衍射能力强则应收高分辨率数据，角大分辨率高但收高分辨率数据时必定会牺牲低分辨率数据质量。所以对一个新蛋白来说，也可先收一次中等分辨率的数据，以满足起始工作的要求。如用分子置换法，则最初用4A数据也可以了。多对同晶置换法跟踪肽链走向时有3A电子密度图也足够了。低分辨率电子密度图比高分辨率电子密度图连续性好，当然粘连也严重。,徊摆角度：在不增加衍射点重叠条件下，徊摆角
22、尽量大，这与晶胞大小有关。100A左右大约每幅画面12曝光时间：取决于晶体衍射能力和晶体在X射线下的寿命（或稳定性）。如果衍射能力弱，寿命又短，则要在这二者之间取得平衡，减少曝光时间可收集更多画面得到一套完整的数据，但衍射点强度相对弱，数据误差可能大一些。加长曝光时间可能要两颗晶体才能收集一套完整数据，则数据合并时也会加大数据的误差。,4.4.3数据收集中的一些技巧,在一定分辨率下衍射点数的估算 (4/3)(1/dm)3/(1/v)n = (4/3)(v/dm)减少盲区：用较短的波长（这在同步辐射中能实现）或把晶体对称轴略偏旋转轴几度（这比较费时，不值得尝试）最有效的收集数据，主对称轴为徊摆轴
23、，间隔地分段收集，减少晶体损伤与吸收，用较短波长增大反常散射效应 用接近元素吸收边的波长,4.4.4数据处理（Denzo程序）,我们知道每幅画面上的衍射点的位置及其指标是有许多因素决定的。当然晶体的晶胞参数是最重要的决定因素，其次是晶体对X射线的取向。另外晶体的镶嵌度(mosaicity)，入射线的位置，每幅画面迥摆角的范围，晶体到IP的距离等各种因素都对衍射点的位置有影响。这些参数有的是完全不知道的，有些虽知道但还需更精确的数值，以便使预测点和实际点更符合。为了得到正确的衍射强度，要选择适当的衍射点大小(spot)和积分面积(box)。执行Denzo程序就能使未知的参数如晶胞参数晶体取向参数
24、变成已知，不精确的参数更精确了。,使用Denzo一般分三步. 第一步自动指标化，得到晶体的格子类型，晶胞参数，晶体取向参数，X射线位置座标等信息。如果显示的预测点和实际衍射点基本一致，则自动指标化过程正常。并输出14种格子和晶胞参数变形表，晶体取向参数等信息。选取最高对称性而又有最小变形的格子，作为你的晶体可能的格子类型。 第二步用Fit命令修正有关的参数。一般先修正晶体取向参数，晶胞参数和射线位置参数，并从中等分辨率逐渐向高分辨率扩展。注意有些参数是高度相关的，不要同时修正，除非你有高质量高分辨率的数据。当某些参数不再需要修正时，也可固定这些参数，修正其它参数。,第三步调节镶嵌度和点的形状和
25、大小，以求得衍射点的积分强度。如果实际衍射点多于预测点则增加镶嵌度值，反之则减小。预测点的形状和大小是否与实际点吻合，可通过Image Window窗口考察，并改变椭球长短轴的值使两者更好的吻合。 执行Denzo程序输出一个文件叫“.x”，它含有一些参数及衍射点指标hkl，强度I等13项信息。修正结果好的话2值应接近1或在2以下。当你第一幅画面处理完後，可用批处理方式处理所有其它画面。得到一系列的“.x”文件，供Scalepack程序用。,Scalepack 的说明 由于数据收集过程中晶体衍射能力有衰减，不同方位时晶体对射线的吸收情况也不同，以及射线强度的涨落等因素，所以对称性联系起来的等效衍
26、射点，它们之间的强度并不相等。因此，要选择一幅画面作为参考，计算每一幅画面的比例因子k和B因子，用k因子B因子校正後，把Denzo输出的所有“.x”文件中的等效点进行平均和合并；并用全部数据对晶胞参数，晶体取向，镶嵌度进行更精确的修正。最後给出一套完整的数据文件“.sca” 及对数据的统计分析。Scalepack不仅可以比例合并从一个晶体来的衍射数据，也可有其它的应用。用于重原子衍生物的搜寻，即收集几幅衍生物的画面与母体数据相比，以检验是否是一个有用的衍生物；多套母体数据的合并；对某些空间群与另一套数据合并时的重新指标化；完整的两套数据比较；反常散射信息的探测；高分辨率数据和低分辨率数据的合并
27、。决定晶体所属的空间群。,4.4.5数据质量评价,完整度（completeness）:80%以上，分壳层完整度随分辨率降低丰度（redundancy）：23倍以上Rmerge:总体3-11% 分壳层的R随分辨率而升高，但最高壳层不应超过25为好,4.5相角测定,多对同晶置换法分子置换法多波长反常散射法直接法,4.5.1多对同晶置换法,多对同晶置换法基本原理 FpFhFph|Fp|、|Fph|可从实验得到。设法解得Fh|Fh|exp(ih)有了|Fp|、|Fph|、|Fh|及h理论上可以得到二个 Fp的解，如果有两个以上的重原子衍生物，即有|Fph1|、|Fph2|就有可能得唯一的Fp了。这就是
28、多对同晶置换原理的基本思想。一般步骤：1用浸泡法制备重原子衍生物 2收集母体和重原子衍生物的衍射数据 3确定重原子位置 4修正重原子参数 5计算相角及电子密度图,4.5.1.1重原子衍生物制备,基本上靠运气和经验。可以从蛋白质分子的氨基酸组成来考虑。自由巯基常是Hg试剂的结合位点，His也常是重原子的配体，Met中S常和Pt试剂结合，镧系锕系的金属离子与Glu，Asp重原子衍生物鉴定 同晶度好 强度变化明显且衍射强度的平均变化不随分辨率提高而增加，结合位点少而每个结合位点占有率高,4.5.1.2确定重原子位置,由于大分子和小分子的明显差别，不能用小分子的传统Patterson法测定大分子中重原
29、子的位置。一般要用各种差值 Patterson，衍生物和母体蛋白的强度差。想象为只有重原子在蛋白质分子晶胞内。为了求差一定得把两套强度数据统一在同一水平上才能相减,同晶差值Patterson法 (Fiso)2=(kFPH - FP)2FH2Cos2(PH -H)反常差值Patterson法 (Fano)2=(FPH(+) - FP(-)2FH2Sin2(PH-H)优点是同一晶体的数据与比例因子无关，缺点是反常差一般比同晶差小，要求强度测量更精确加和差值Patterson法(Fiso)2 + (Fano)2FH2这两者的加和近似一常数。同晶差贡献小的衍射点则反常差贡献就大。两者结合比单独使用任一
30、种函数要好。联合差值（Matthews加和）|FH|2=|FP|2+|FPH|22|FP|FPH|1-(f/f)( FPH(+) - FPH(-)/2|FP|1/2,4.5.1.3共同原点,由于各衍生物在确定重原子位置时所取的坐标原点不同，它们对相角会有影响，解决办法1 用第一个重原子衍生物得到母体蛋白的初步相角，然后用差值Fourier方法确定第二个重原子衍生物的重原子位置，此时所得的第二个衍生物中重原子位置与第一个衍生物有相同的原点。(xyz)=|FPH2| - |FP|exp-2i(hx+ky+lz) + iP2 Rossmann法计算以(|FPH2|-|FPH1|)2为系数的Patte
31、rson加和(|FPH2|-|FPH1|)2=(|FPH2|-|FP|)-(|FPH1|- |FP|)2 =(|F|iso)2 - (|F|iso)12这类Patterson图中有每个衍生物中的重原子自身的向量峰，而两种衍生物中的重原子间交叉向量表现为负峰，找到该交叉向量就可推出第二个衍生物中重原子按第一个衍生物所取的原点为原点时的正确位置。,4.5.1.4重原子参数的修正,1 有好的FH(obs)则可用简单的最小二乘法修正，即令 WFH(obs)-FH(calc)2为极小值。2 相角修正。如果有初步的蛋白质相角P, 则用WFPH(obs) - FPH(calc)2为极小值,FPH(calc)
32、=| FP(calc) + FH(calc)|,4.5.1.5蛋白质相角,按照一定的间隔（如30）计算不同p值下的该相角的几率，然后在最大几率的角度附近再按每5的间隔计算该相角的几率，最终确定同晶置换相角。,4.5.2分子置换法,用已知的同源蛋白的分子结构，置换到待测晶体中目标分子的位置，得到晶体结构的初步模型，计算它的相角，再从电子密度图进一步改进模型。空间两个相同的分子X2，X1，一定可以通过旋转和平移使两个分子重合。 X2CX1d C就是旋转矩阵，d就是平移向量。模型分子的选取，根据氨基酸序例比较，同源性越高得到正确解的可能性越大。模型分子结构精度越高越容易得到正确解。残基不同则可用AL
33、A或GLY取代。如果有大段的插入，则可把它删去。由于目标分子结构并不知道，所以不可能用相应原子的坐标去叠合，只能用分子的某些特性去叠合。分子置换法就是利用分子内原子间的向量峰来叠合，如果两个分子相似，则它们分子内原子间向量峰就很相似。,4.5.2.1旋转函数,R(,)vP1(X)P2(CX)dXP1是已知分子结构的模型晶胞的Patterson函数P2是待测分子的晶胞的Patterson函数这是交叉旋转函数，就是将两个Patterson矢量峰叠合，当两个分子取向一致时两个Patterson函数的乘积就会得到最大值，形成高峰。自身旋转函数。如果P1，P2都是目标晶胞的Patterson函数，则称为
34、自身旋转函数。它可用来研究不对称单位内有多个分子或亚基时的取向关系，也就是非晶体学对称性。自身向量峰即一个分子内的原子间向量峰，这是最能反映分子本身结构特点的向量峰。旋转函数计算时要要尽量避免交叉向量峰，即分子间的原子间的向量峰。,如何避免交叉向量峰？模型晶胞的选取：模型晶胞越大，则它的分子间Patterson向量峰离原点越远，因此，在一定的积分半径范围内，分子间的交叉向量峰越少，但计算工作量加大。这两者要取得平衡。一般取分子最小径线积分半径分辨率积分半径：分子线度60-80%，分子直径75-80%在计算交叉旋转函数时一般用尤拉角坐标系1，2，3在计算自身旋转函数时一般用球极坐标系(,),4.
35、5.2.2平移函数,当分子取向决定后，就要找到分子在晶胞中的确切位置，平移函数的计算就是为了确定分子在晶胞中的位置。T(t) P0(u)P(ut)du 平移函数一般在二维平面内计算，两个不同方向的截面可确定三个分量，平移函数的峰值主要由分子间的向量峰决定的（附图）。另外，R值的搜索也可确定平移向量。,4.5.3多波长反常散射法4.5.3.1反常散射确定蛋白质相角,单对同晶置换加反常散射法确定蛋白质相角有反常散射原子的原子散射因子f=f0+f+if图9.2图9.3 这两个图都说明利用一个重原子衍生物的数据可以唯一确定蛋白质的相角，但是这两套蛋白质相角是不同的，原因是重原子的位置不同（xyz）与（
36、-x,-y,-z）。,4.5.3.2利用反常散射确定分子绝对构型,先在正确的右手坐标系中确定F(hkl)和F(-h,-k,-l)，然后分别用两套坐标(即一为xiyizi另一为-xi,-yi,-zi)计算Fc(hkl)和Fc(-h,-k,-l)，最后比较Fc（h）/Fc（-h），Fo（h）/Fo（-h）大于1或小于1，若两者一致，则所选绝对构型是正确的。对大分子情况更复杂。以上节为例作一说明。利用这两套不同的相角，对第二个重原子衍生物做差值Fourier图。 |FPH2|FP|一套相角 |FPH2|FP|另一套相角 正确的绝对构型会在第二个重原子衍生物的重原子位置显示最高的峰。 磷酯酶晶体用第一
37、个Pt衍生物得到的两套相角SIRAS对第二个Hg衍生物作差值Fourier图。Hg1（峰高）Hg2(1)错误构型342616(2)正确构型5011036,4.5.3.3多波长反常散射法应用前提,Se代甲硫氨酸，每150a.a一个Se就可成功应用此法。要求：有可调波长同步辐射源，要精确测量Friedel点对的反常差，也就是数据精度要高，波长选择近重原子吸收边，另外两个波长的强度差别也要大，F = |F(i)| - |F(j)|，|F(i)|（1/2）|Fh|Fh|,4.5.3.4多波长反常散射法基本原理,结构中所有原子的非反常散射部分与反常散射部分分开最后推出|F|2=|FBA|2+p|FA|2
38、+|FBA|FA|qcos(BA-A)+rsin(BA-A)p=(f) 2+( f)/( f0) 2, q=2f/ f0，r=2 f/ f0p，q，r是函数，从原子吸收系数得到|F|2可从实验测得对每一Friedel点对即(hkl)(-h,-k,-l)，|FBA|，|FA|，(BA-A)是不知道的，但它们与无关，对Friedel点对是相等的，仅BA-A符号不同。一个对这三个未知数给出二套等式，所以原则上用两个不同波长可以解出每一反射的FBA，|FA|和(BA-A)。,要计算蛋白质电子密度图需要BA。用|FA|2作系数计算Patterson图，解出重原子A位置，然后由A的位置计算A，再从(BA-
39、A)值和A得到BA。由于在计算A结构时没有考虑反常散射，所以得到的是两种对映体的结构都可能的。（也即原子位置可以是（xyz）也可以是（-x,-y,-z）每个波长的f，f是原子吸收系数的函数，原子吸收系数可从实验测得。,4.6相角改进4.6.1溶剂平滑化,方法基础是蛋白质分子有较高的电子密度，而溶剂区电子密度很低，对电子密度作一改造i=kwii先确定分子边界，溶剂体积开始时比估算的要略小1015，以后逐步增加，至少比估算值低5，这是为了避免把分子表面的loop区去掉，在溶剂区给予溶剂密度的平均值，然后从图反变换得到相角。流程图,4.6.2分子平均,如果不对称单位内有多个分子，则可利用非晶体学对称
40、性对多个分子进行分子平均。这可改进电子密度图，因为误差是随机的，在各个分子中的分布是不同的，平均后可提高电子密度图的信噪比。1用分子置换法的自身Patterson函数得到非晶体学对称性。2确定分子边界。比实际分子边界略小，因为受分子堆积环境影响，分子表面略有不同，但又要尽可能多的包括蛋白质分子的密度。,3电子密度平均。把各分子内对应点的电子密度平均。溶剂区电子密度抹平，等于该区域内的平均电子密度，这样得到一个新的电子密度图。4用Fourier反变换，从电子密度图得出新的相角。5用观察结构因子振幅和新相角计算新的电子密度图。分子平均对非晶体学对称性高的病毒结构特别有用。,4.7电子密度图的计算和
41、解释,5A分辨率的图可划分出分子边界，辨认螺旋，但一般很难跟踪肽链走向。 中等分辨率的图上，可以跟踪肽链走向。辨认片层和芳香环侧链，根据一级结构建立分子模型。 高分辨率的图，建立分子精细模型寻找水分子。,4.8结构修正4.8.1修正的目标,调节初始模型，使按模型计算的结构因子振幅和实验测得的结构因子振幅尽可能的接近。用R因子表示 R(|Fo|-|Fc|) / (|Fo|) 大分子一般R在20以下就可以了,4.8.2立体化学制约的最小二乘法,小分子结构修正中普遍使用的最小二乘法在大分子结构修正的早期遇到了麻烦。主要是观察值Fo和结构修正的参数之比非常小。因此，要尽可能的增加观察值的数量，减少待修
42、正的参数，于是产生了立体化学制约的修正方法constrained和restrained。 Constrained把分子作为刚体，仅二面角能变，也就是键长、键角均固定了。这就减少了待修正的参数。这适宜于整个结构移动，不适宜对结构局部进行调整。,Restrained允许立体化学参数在标准值范围附近变化。如键长、键角、扭角、VDW接触、芳香环的共面性、不对称碳原子C的手性等，立体化学的标准值是从小分子结构测定中得出的，这些标准值就作为“观察值”，所以restrained是增加“观察值”。 另外，在极小函数内也可包括有关的能量项，这些能量项也与键长、键角有关。,4.8.3分子动力学方法或模拟退火,当初
43、始模型存在比较大的错误时，用立体化学制约的最小二乘法修正结构，有时分子的局部构象会走到错误的局部能量极小态，所以模型需要经常用图象工作站进行手工调整。 分子动力学方法就是为了在修正过程中避免分子进入错误的局部能量极小状态。它先加热分子至2000K或3000K，使分子有足够的能量克服势垒，然后再缓慢冷却模型，使分子达到最低能量状态。,4.8.4结构可靠性的检验,1.分子结构模型与电子密度图的符合情况，差值电子密度没有突出的峰需要解释的2.R因子和Rfree3.立体化学偏差rms，键长0.015A、键角3以下，分子内或分子间没有过近接触4.每个残基的值在Ramachandran图允许范围内5.残基的温度因子分布，侧链原子的平均温度因子大于主链原子平均温度因子，处于表面的残基温度因子大于疏水内核的残基温度因子。6.从luzzati图估计原子坐标误差，一般2A分辨率结构R因子在20，原子坐标平均误差约在0.2A0.3A。,The End,
