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1、酵母细胞的固定化,课题3,如今，酶已经大规模地应用于食品、化工、轻纺、医药等各个领域。在应用酶的过程中，人们发现了一些实际问题：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混中产物中，可能影响产品质量。,课题背景,于是，有人设想，将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。现代的固定化酶技术已完全实现了这一设想。高果糖浆的生产就是固定化酶技术成功地应用于工业生产的实例。,酶是由细胞合成的，于是，又有人设想，能否将合成酶的细胞直接固定？自20世纪70年代，在
2、固定化酶技术的基础上，又发展出了细胞固定化技术。与固定化酶技术相比，固定化细胞制备的成本更低，操作更容易。本课题中，我们将动手制备固定化酵母细胞，体会固定化酶的作用。,通过课题背景分析，你有何体会？,酶：,固定化酶：,固定化细胞：,思考:,优点：,实际问题：,设想：,催化效率高，低耗能，低污染,对强酸、强碱、高温等环境条件敏感，易失活；,反应后酶混在产物中，如不去除，会影响产品的品质.,将酶固定在不溶于水的载体上.,溶液中的酶很难收回，不能被再次利用，提高了生产成本；,酶既能与反应物接触，又容易与反应物分离，同时，还可以反复利用.,优点：,实际问题：,一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中
3、，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能完成的.,酶是细胞合成的，能否将合成酶的细胞直接.固定？,成本低，操作更容易.,设想：,优点：,阅读P49-50，并思考：1、解决酶应用中存在问题的方法是什么？2、这种方法的优点是什么？3、什么是高果糖浆？使用它有何好处？4、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？这种酶有何特点？5、了解高果糖浆生产过程。,一、固定化酶的应用实例,基础知识,固定化酶技术。即将酶固定在一定空间内的技术（如固定在不溶于水的载体上）。,（1）使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；（2）固定在载体上的酶可以被反复利用。,1、解决酶应用中存在问题的方法是什么？,2、这种方法的优
4、点是什么？,3、什么是高果糖浆？使用它有何好处？,一、固定化酶的应用实例,高果糖浆是果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人的健康有利。,4、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？这种酶有何特点？,生产高果糖浆需要葡萄糖异构酶；其作用是将葡萄糖转化为果糖；这种酶稳定性好，可持续发挥作用。,1、什么是固定化酶或细胞技术？,阅读P50内容，思考以下问题：,二、固定化细胞技术,2、细胞（或酶）固定化的常用方法有哪些？,3、酶和细胞固定方法的选择及原因？,4、固定化细胞常用的不溶于水的多孔性载体有哪些？,二、固定化细胞技术,1、什么是固
5、定化酶或细胞技术？,2、细胞（或酶）固定化的常用方法有哪些？,利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。,包埋法,将酶（或细胞）包埋在细微网格里,化学结合法,将酶（或细胞）相互连接起来,吸附法,将酶（或细胞）吸附在载体表面,3、酶和细胞固定方法的选择及原因？,酶适合采用化学结合和物理吸附法固定,细胞适合采用包埋法固定,（1）方法,（2）原因,细胞体积大，酶分子很小,体积大的细胞难以被吸附或结合，而体积小的酶容易从包埋的材料中漏出,4、固定化细胞常用的不溶于水的多孔性载体有哪些？,明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等,1从操作角度来考虑，你认为固定化酶技术与固定化细胞技术哪
6、一种方法更容易？哪一种方法对酶活性的影响更小？,固定化细胞技术,固定化细胞固定的是一系列酶,固定化细胞技术,固定化酶技术,2固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？,3如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种方法？,4如果反应物是大分子物质，又应该选择哪种方法？,思考,（大分子物质不能进入细胞）,（一）制备固定化酵母细胞,阅读P5051思考下列问题：,（1）制备过程包括哪几个步骤？（2）你认为哪个步骤的操作是最重要的一环？（3）各步骤应当分别注意什么问题？,实验操作,1、酵母细胞的活化,思考： 关于酵母菌你有哪些知识？,（一）制备固定化酵母细胞,什么是活化？其本质是什么？活化的方法
7、是什么？具体操作过程？操作过程中应注意什么？,1、酵母细胞的活化,（一）制备固定化酵母细胞,本质：,方法：,活化：让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。,加快新陈代谢。,加入适量的水。,操作过程：,注意事项：,取1g干酵母，放入50ml的小烧杯中，加入蒸馏水10ml，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右使其活化。,（1）所用容器要大一些；（2）要保证酵母菌的活性； （3）物种要单一； （4）注意水的用量。,2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液,称取无水 CaCl2 0.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml的蒸馏水，使其充分溶解，待用。,溶
8、解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果。,操作过程：,注意事项：,3、配制海藻酸钠溶液,称取0.7g海藻酸钠，放入50mL小烧杯中。加人10mL蒸馏水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10mL。,加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。,操作过程：,注意事项：,包埋酶或细胞,防止焦糊,配制的海藻酸钠溶液具体作用是什么？,在加热的过程中，为什么要用小火，或者间断加热？,思考,加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，涉及到实验的成败，一定要按照教材的提示进行操作。 海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海
9、藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。,特别提醒,将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。,操作过程：,注意事项：,溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高杀死酵母菌。,搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。,4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合,5、固定化酵母细胞,以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。,操作过程：,可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照。,海
10、藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30min左右。,注意事项：,刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。 检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法：一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。,特别提醒,（二）用固定化酵母细胞发酵,操作过程：,注意事项：,1、将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2-3次。 2、将150mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200mL的锥形瓶中，再加入
11、固定好的酵母细胞，置于25下发酵24h。,控制好发酵温度，一般是室温25。,发酵时间一般时间稍长一些，效果明显。,可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理，对照实验结果。,结果分析与评价,如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少。,（一）观察凝胶珠的颜色和形状,如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，则说明什么？,如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明什么？,如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。,当观察到哪些现象时，可说明实验获得成功？为什么？,利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。,
12、（二）观察发酵的葡萄糖溶液,课后练习,3.因为酶的结构具有多样性，对理化条件的敏感程度不同。,2、葡萄糖通过装有固定化酵母细胞的反应柱，在无氧条件下，在固定化酵母细胞分泌的酶的作用下变为酒精，酒精通过底部的筛板滤除，固定化酵母细胞仍然保留在反应柱内。,1.,1、酶固定化技术与细胞固定化技术的关系是A 酶固定化技术是细胞固定化技术的基础B 细胞固定化技术是酶固定化技术的基础C 酶固定化技术与细胞固定化技术是同时发展起来的D 固定化细胞技术先于酶固定化技术,练习巩固,2、固定化酶技术常采用A 包埋法 B 化学结合和物理吸附法C 活化法 D 微囊化法3、海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要经过加热促进
13、其溶解，采用的最好加热方法是A 快速加热 B 持续高温加热C 小火间断加热 D 灼烧加热,4、酵母菌的活化是指A 让酵母细胞恢复运动状态B 让酵母细胞在缺水状态下更容易休眠C 让酵母细胞内酶活性加倍D 让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态,5、细胞固定化技术与酶固定化技术相比，所具备的特点是A 成本更低、操作更容易、不能连续性生产B 成本更高、操作更难、不能连续性生产C 成本更低、操作更容易、能连续性生产D 成本更低、操作更难、能连续性生产,6、下列说法不正确的是A、葡萄糖与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成的是果糖B、从固定化酶反应柱下端流出的是果糖C、高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、
14、糖尿病、龋齿和心血管病D、酶溶解于葡萄糖溶液，可以从糖浆中回收,7、研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的。如将从大肠杆菌得到的磷酸三酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可以用来降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的A、温度 B、PHC、水分 D、营养,8、目前，日用化工厂大量生产的酶制剂，其中的酶大都来自A、化学合成 B、动物体内 C、植物体内 D、微生物体内,9.使用固定化细胞的优点是A.能催化大分子物质的水解 B.可催化一系列化学反应C.与反应物易接近 D.有利于酶在细胞外发挥作用,10.酶的固定方法不包括A. 将酶吸附在固体表面上 B将酶相互连接起来C将酶
15、包埋在细微网格里 D将酶制成固体酶制剂，如加酶洗衣粉中的酶,11、如果反应物是大分子物质，采用那种方法催化受限制A直接使用酶 B使用化学方法结合的酶C使用固定化细胞 D使用物理吸附法固定的酶,12、下列关于酶和细胞的固定叙述不正确的是A酶分子很小，易采用包埋法 B酶分子很小，易采用化学结合或物理吸附法固定的酶C细胞个大，难被吸附或结合 D细胞易采用包埋法固定,13. 关于固定化酶的叙述不正确的是A既能与反应物接触，又能与反应 物分离 B固定在载体上的酶可被反复利用C可催化一系列反应 D酶的活性和稳定性受到限制,14、固定化细胞对酶的活性影响最小，根本原因是A避免了细胞破碎、酶的提取纯化过程 B固定化细胞在多种酶促反应中连续发挥作用C促化反应结束后，能被吸收和重复利用D细胞结构保证了各种酶在细胞内化学反应中有效的发挥作用,15、如果反应物是大分子物质，一般不采用固定化细胞技术，主要原因是A大分子物质运输过程中耗能多B大分子物质难以自由通过细胞膜C大分子物质反应物装到一个反应柱内，可再次利用以上说法都正确,
