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1、1,Contact me,苏湘鄂Tel:26535432 (O), 13928802516Email: xsuszu.eduOffice: S327A,2,CHAPTER 9,核糖体Ribosome,3,OUTLINE,Ribosome structureRibosome FunctionPolyribosome and Protein synthesis,4,Background about Ribosome,1953 Robinsin, Brown (Plant cell)1955 Palade (Animal cell)1958 Roberts name it as RIBOSOMERi
2、bosomes exist in almost all kinds of cells.Eukaryotic cell Prokaryotic cell Mycoplast (支原体）ChloroplastMitochondrionNo membrane around it,5,Ribosome structure 核糖体(ribosome)是细胞内一种核糖核蛋白颗粒(ribonucleoprotein partical),是细胞内合成蛋白质的细胞器。 核糖体的主要成分是核糖体RNA(rRNA), 占60%, 蛋白质(r蛋白质), 占40%。,6,结 构,大亚基,小亚基,柄,中心突,嵴,平台,头
3、部,裂沟,基部,50S,30S,mRNA,mRNA,tRNA,多肽,中央管,5，,3，,mRNA,A部位,P部位,G因子,T因子,核糖体的四个活性部位,7,Structure of ribosome,?,video.sina/v/b/20860082-1402872485.html#20860082,8,核糖体的类型,细胞有两种主要类型的核糖体:原核细胞的核糖体: 沉降系数为70S，分子量为2.5x106,由50S和30S两个亚基组成。真核细胞的核糖体: 沉降系数是80S，分子量为2.5x106,由60S和40S两个亚基组成。,9,Mg2+ 浓度对大小亚基的聚合和解离的影响:70S核糖体在Mg
4、2+的浓度小于1mmol/L的溶液中易解离; 当Mg2+ 浓度大于10mmol/L, 两个核糖体通常形成100S的二聚体。,10,镁离子浓度对核糖体的影响,11,各种来源的核糖体亚基组成,来源 完整核糖体 核糖体亚基 核糖体RNAs细胞质(真核生物) 80S 60S(大亚基) 28S 40S(小亚基) 18S，5.8S,5S细胞质(原核生物) 70S 50S(大亚基) 23S 30S(小亚基) 16S，5S线粒体(哺乳动物) 55-60S 45S(大亚基) 16S 35S(小亚基) 12S线粒体(酵母) 75S 53S(大亚基) 21S 35S(小亚基) 14S线粒体(高等植物) 78S 60
5、S(大亚基) 26S 45S(小亚基) 18S，5S叶绿体 70S 50S(大亚基) 23S 30S(小亚基) 16S，5S,12,核糖体的化学组成,rRNA,蛋白质,原核细胞核糖体(70S)： 1.5:1,真核细胞核糖体(80S) : 1:1,化学组成,70S核糖体,50S,30S,80S核糖体,60S,40S,23S RNA,16S RNA,5S RNA,28S RNA,5.8S RNA,5S RNA,18S RNA,34种蛋白质,21种蛋白质,45种蛋白质,33种蛋白质,13,14,核糖体的装配,原核生物核糖体的装配小亚基的rRNA和蛋白质的装配关系: 组成核糖体的蛋白质和rRNA在大小
6、亚基中均有一定的空间排布。,15,原核生物rRNA前体的加工,16,核糖体结合蛋白,17,核糖体的合成与装配,18,19,Ribosome Function核糖体的功能-蛋白质的合成,20,Three binding site for tRNAs,A site: 氨酰基-tRNA结合位点P-site: 肽酰基-tRNA结合位点E-site: 释放位点,v.youku/v_show/id_XMTY1ODg5OTY4.html,21,22,肽链合成的起始,三元复合物的生成：起始因子(IF3)30S小亚基 + mRNA（起始信号部位） + IF3 IF3 -mRNA-30S三元复合物30S前起始复合
7、物的形成：起始因子(IF2)IF3 -mRNA-30S三元复合物 +IF2+fMet-tRNAf IF2 -30S-mRNA-fMet-tRNAf70S起始复合物的形成：GTPGDP+PiIF2 -30S-mRNA-fMet-tRNAf+50S大亚基 30S-mRNA-50S-fMet-tRNAf+IF2,23,肽链合成的起始,IF3,IF3,IF3 -mRNA-30S 三元复合物,IF2 -30S-mRNA-fMet-tRNAf,30S-mRNA-50S-fMet-tRNAf,IF2,IF3,IF2,A位,IF3 -mRNA-30S三元复合物,IF2 GTP,IF3,A位,24,原核和真核生
8、物蛋白质合成起始的区别,完整核糖体 70S 80S,核糖体亚基 50S，30S 60S，40S,起始tRNA fMet-tRNAfMet Met-tRNAiMet,起始因子 三种 至少七种,起始复合物 1. 30S-mRNA 1. 40S-Met- tRNAiMet,主要顺序 2. 30S-mRNA- fMet-tRNAfMe 2. 40S-mRNA -Met- tRNAiMet,3. 70S-mRNA- fMet-tRNAfMe 3. 80S-mRNA -Met- tRNAiMet,25,肽 链 的 延 长,1.氨酰基-tRNA 进入A位,肽链的延长,2.肽键的形成,3.移位,循环重复过程,
9、参与的因子,延长因子（ EF ),EF-T(EF-1):与氨基酰-tRNA和GTP结合形成一种复合物，并将其带到核糖体上。,EF-G(EF-2):帮助肽酰基-tRNA由核糖体A位移向P位。,GTP:提供能量,26,fMet,肽 链 的 延 长,1.氨酰基-tRNA 进入A位,2.肽键的形成,U A C,肽基转移酶 形成肽键,3.移位(由A位转移至P位）,EF-G,易位酶G因子,A C U U A G,A C U U A G,A C U U A G,EF-T GTP,密,27,fMet,U A C,C G G,肽链合成的终止与释放,U G A,U G A,28,IF3 -mRNA-30S三元复合
10、物,IF2 GTP,IF3,A位,fMet,U A C,C G G,U G A,U G A,肽链合成的起始,肽 链 的 延 长,肽链合成的终止与释放,29,核糖体合成的蛋白质,完,30,核糖体蛋白与rRNA的功能,核糖体上具有一系列与蛋白质 合成有关的结合位点与催化位点,31,与mRNA的结合位点与新掺入的氨酰-tRNA的结合位点氨酰基位点，又称A位点与延伸中的肽酰-tRNA的结合位点肽酰基位点，又称P位点肽酰转移后与即将释放的tRNA的结合位点E位点(exit site)与肽酰tRNA从A位点转移到P位点有关的转移酶 (即延伸因子EF-G)的结合位点肽酰转移酶的催化位点与蛋白质合成有关的其它
11、起始因子、延伸因子和 终止因子的结合位点,核糖体结合位点,32,在核糖体中rRNA是起主要作用的结构成分,具有肽酰转移酶的活性；为tRNA提供结合位点(A位点、P位点和E位点)；为多种蛋白质合成因子提供结合位点；在蛋白质合成起始时参与同mRNA选择性地结 合以及在肽链的延伸中与mRNA结合；核糖体大小亚单位的结合、校正阅读(proofreading)、 无意义链或框架漂移的校正、以及抗菌素的作用等 都与rRNA有关。,33,r蛋白质的主要功能,对rRNA 折叠成有功能的三维结构是十分重要的；在蛋白质合成中, 某些r蛋白可能对核糖体的构象 起“微调”作用； 在核糖体的结合位点上甚至可能在催化作用
12、中, 核 糖体蛋白与rRNA共同行使功能。,34,问题,如何证明在核糖体合成蛋白质过程中起主要功能作用的是RNA，而不是蛋白质？,？,35,蛋白质合成抑制剂（抑制核糖体与tRNA结合）抗生素嘌呤霉素,36,多聚核糖体(polyribosome或polysome),蛋白质正在合成时的一种状态。,37,多聚核糖体,38,多聚核糖体(polyribosome或polysome),概念 核糖体在细胞内并不是单个独立地执行功能，而是由多个 甚至几十个核糖体串连在一条mRNA分子上高效地进行肽 链的合成，这种具有特殊功能与形态结构的核糖体与 mRNA的聚合体称为多聚核糖体。多聚核糖体的生物学意义细胞内各种
13、多肽的合成，不论其分子量的大小 或是mRNA的长短如何，单位时间内所合成的 多肽分子数目都大体相等。以多聚核糖体的形式进行多肽合成，对mRNA 的利用及对其浓度的调控更为经济和有效。,39,RNA在生命起源中的地位及其演化过程,40,生命是自我复制的体系,三种生物大分子，只有RNA既具有信息载体 功能又具有酶的催化功能。因此，推测RNA 可能是生命起源中最早的生物大分子。核酶(ribozyme)：具有催化作用的RNA。由RNA催化产生了蛋白质,41,DNA代替了RNA的遗传信息功能,DNA双链比RNA单链稳定； DNA链中胸腺嘧啶代替了RNA链中的尿嘧啶，使之易于修复。,42,蛋白质取代了绝大
14、部分RNA酶的功能,蛋白质化学结构的多样性与构象的多变性；与RNA相比，蛋白质能更为有效地催化多种生化反应，并提供更为复杂的细胞结构成分，逐渐演化成今天的细胞。,43,核糖体与癌症,蛋白质是生命活动的最终执行者，核糖体担负着细胞中蛋白质的合成，因此核糖体在整个生命过程中发挥重要功能。核糖体的生物合成和转录控制在细胞处理过程中多个水平进行。目前已经发现一些肿瘤抑制子和前癌基因可以影响核糖体成熟，通过改变蛋白质合成机器中的某些组分而诱导肿瘤的发生。,44,单一蛋白质突变控制核糖体生物合成,低等生物L16：在酵母菌中进行的基因靶向试验表明单一一种蛋白质的去除如L16，导致60s核糖体大单位减少，这直
15、接与多核糖体减少和细胞增殖缺陷相关。因此仅一种核糖体蛋白质的表达被破坏就能够引起核糖体产生的减少。其它的蛋白质：在果蝇中，单一的核糖体蛋白质突变就可以导致一组综合性突变，被称为minute。 Mintue 苍蝇是以体积减少为特征，失去生育能力和隐性的致死性。许多直接和间接的证据已经证实minute细胞核糖体含量降低，因此蛋白质合成能力降低。蛋白质合成的减少导致了细胞生长和增殖的降低。,45,高等生物：S6：小鼠中去除40s核糖体蛋白质S6，直接导致了核糖体生物合成的缺陷和细胞增殖的降低。而S6磷酸化可以被癌细胞中失调的细胞外信号进行调节。S6磷酸化与特异的一组被称为TOP的mRNA翻译相关（T
16、OP:a terminal oligopyrimidine bract in the 5 untranslated region(UTR)）。由TOP基因编码的蛋白质本身即为一种原癌基因，因此，TOP基因的表达失调也许启动了肿瘤的发生。哺乳动物中，S6磷酸化的调节是非常复杂的。这种复杂性提高归因于另一种激酶S6K2的存在。,46,S3a ：在肿瘤细胞中过量表达。显然单个核糖体蛋白质删除在许多模型组织中可以直接影响细胞的生长，但是对核糖体蛋白质的过量表达还没有清晰明朗的认识。核糖体蛋白质S3a过量表达可以诱导NIH3T3细胞转型突变，并在裸鼠中诱导肿瘤的产生。S3a诱导转型突变的能力依赖于其抑制
17、程序性死亡的作用，因此S3a也许引起了抗凋亡蛋白的上调。,47,癌症和核糖体的生物合成,先天性角化不良症 DKC1编码假尿嘧啶合成酶，通过在特异位点将尿嘧啶转变成假尿嘧啶而介导了rRNA转录前的调节。DKC1基因的突变与DC相关。 在酵母和苍蝇中，DKC1的缺陷导致了rRNA修饰的损伤与核糖体生物合成过渡有关 DKC1也与端粒酶中的RNA合成相关，是否核糖体功能障碍引起了DC的病理过程仍需在动物模型中进一步验证。,48,先天性障碍性贫血：这种疾病已经被确定与核糖体蛋白质S19突变相关 ，一种由于核糖体合成缺陷而使机体具有癌症易感性的疾病。 在Drosophila中，仅一个核糖体蛋白质的突变既可
18、以造成minutue表型。先天性障碍性贫血病人，在出生时有一个生长不足，表现为严重的生长迟缓现象。 两这是否具有相同的发生机制还需要进一步阐明。,49,A protein bound to a specific DNA sequence will interfere with the digestion of that region by DNase I. An end-labelled DNA probe is incubated with a protein extract or a purified DNA-binding factor. The unprotected DNA is t
19、hen partially digested with DNase I such that on average every DNA molecule is cut once. Digestion products are then resolved by electrophoresis. Comparison of the DNase I digestion pattern in the presence and absence of protein will allow the identification of a footprint (protected region),Footpri
20、nt,Exp. Identification of TF binding site: DNase 1 Footprinting,50,RNApol 在DNA上结合位点的鉴定足迹法原理： 限制酶切割结合有RNApol的DNA 大分子DNA 末端标记该DNA（Klenow片段标记3,碱性磷酸酯 酶标记5） 用内切酶降解DNA（控制反应条件） 凝胶电泳分离，放射自显影观察,51,大片段DNA,52,末端标记大分子DNA,重新结合RNApol,作对照直接用DNase 进行降解,电泳,用微量DNase降解,电泳,53,54, 用足迹法鉴定出来的 RNApol 与DNA的结合区域为 +20 50（40），
21、大约 60 70 bp,55,核酶(ribozyme)：有催化活性的RNA,1982年，美国Thomas Cech 在研究四膜虫rRNA自我剪接时发现，在没有任何蛋白酶参与下，含有413bp干扰序列（IVS）的前体rRNA发生了自切割. 同时加拿大的Sidney Altman 发现RNase P分子中的RNA组分有催化活性；1989年分享了Noble 化学奖。 不仅拓宽了生物催化剂的领域，而且对RNA的生物学功能开创了一种历史性的新认识：RNA不仅具有储存和传递遗传信息的功能，而且还具有生物催化剂的功能，在一定程度上可以说，RNA一身兼有DNA和蛋白质两大类生物大分子的功能。,56,核酶-真核
22、生物rRNA的自身剪切,四膜虫 26SrRNA核酶（ribozyme）应用,前体 6.4 kb 414bp内含子 5.986kb 无酶催化，自身剪接具有催化功能的RNA 切割特异性RNA序列具特定的二级结构-槌头结构人工合成核酶的槌头结构 破坏HIV病毒,57,底物,催化部分,图13-11,58,酶,底物,图13-12,59,Match the following with their role in translation._ A series of three tRNA bases complementary to a mRNA codon. (ans)_ The ribozyme tha
23、t forms peptide bonds between amino acids during translation. (ans) _ The ribosomal subunit that binds to mRNA to form the initiation complex. (ans) _ The ribosomal site where an aminoacyl-tRNA first attaches during translation. (ans) _ The ribosomal site where the growing amino acid chain is tempor
24、arily being held by a tRNA as the next codon in the mRNA is being read. (ans) _ A complex of an amino acid and a tRNA molecule. (ans) _ The sequence of bases on mRNA to which a 30S or 40S ribosomal subunit first attaches. (ans) _ A series of three mRNA bases coding for no amino acid and thus termina
25、tes the protein chain: UAA, UAG, UGA. (ans) _ A complex consisting of a 30S or 40S ribosomal subunit, a tRNA having the anticodon UAC and carrying an altered form of the amino acid methionine (N-formylmethionine or f-Met), and proteins called initiation factors. (ans) _ A three-dimensional, inverted
26、 cloverleaf-shaped molecule about 70 nucleotides long to which a specific amino acid can be attached; transports amino acids to the ribosome during translation. (ans) a.30S or 40S ribosomal subunit g. anticodon b. ribosome binding site h. P-site of ribosomec. initiation complex i. A-site of ribosome
27、 d. 50S or 60S ribosomal subunit j. peptidyl transferase e. tRNA k. nonsense (stop) codon f. aminoacyl-tRNA l. release factors m. start codon,60,Questions,Compare the mechanism of translation initiation in prokaryotes and eukaryotes (similarity and difference)How do prokaryotes and eukaryotes find the translation start sites?,61,62,结蛋,63,
