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1、1,提出问题：两个基因或者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接到一起，我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法，但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊或者又很贵，我们可能只用一次，这样购买酶就变成了一种浪费,2,重叠延伸PCR技术的基本原理及其简单运用,姓名：黄保洋学号：20192118030专业班级：生物化学与分子生物学191,2020.05.28,重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过
2、重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.,简介,3,4,特点：可简单迅速将两个DNA片段连在一起，用于嵌合体基因的构建。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物.可以进行定点突变。可以在两基因片段间加入其他序列酶切位点或者标签。丰富的PCR的扩增范围，尤其在获得长DNA片段方面，省去常规克隆的繁琐。,5,过程,6,基本原理,7,两基因的引物设计,A基因：上游（F1）与开放阅读框起始密码子附近的序列相对应，并在5 末端添加酶切位点和3个保护碱基；下游（R1）与A基因终止密码子附近
3、的序列及B基因5末端起始密码子附近的序列互补，并去除A基因的终止密码子TAAB基因：上游（F2）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 端起始密码子附近的序列相对应，同样去除A基因终止密码子TAA；下游（R2）与B基因的开放阅读框终止密码子序列互补，并在5末端添加酶切位点和2个保护碱基。先分别用F1、R1，F2、R2扩增出A和B基因，然后再用F1和R2将两基因连接起来，得到融合基因。,引物的设计,基因1,基因2,F1 引物,R2引物,R1引物,F2 引物,基因1,基因2,基因1,基因2,碱基相同区域，至少20bp,基因1,基因2,PCR怎么样发生反应？,PCR扩增,PCR扩增,8,反应机理,5
4、,5,5,5,3,3,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,加入酶，buffer等反应液。PCR仪中解链，退火单链模板结合,F1 引物,R1引物,F2 引物,R2 引物,无目标产物,5,5,3,3,加入F1引物、R2引物,5,5,3,3,F1 引物,R2 引物,大量扩增目的基因,基因A,基因B,9,10,实际操作注意点a.第一步PCR之后的产物，可以纯化，也可以吸取几L作为重叠PCR的模板。c.Taq酶会在末端加A，高保真酶有3 5的外切活性，基于重叠PCR原理和酶的性质，第一步和重叠PCR步骤至少有一步使用高保真酶（或者如Taq Plus、Es Taq之类的，有3 5的外切活性），如果第一
5、步和重叠PCR都使用普通Taq可能重叠PCR会失败。d.基于重叠PCR原理，上图中第二步A D 链直接的退火很关键，所以退火温度很重要。 反应的退火温度也要根据引物而定，在保证产物扩增效率的前提下，应尽量提高退火温度以提高产物的特异性，为下一轮PCR反应提供高质量的模板，从而降低反应的错配率热循环条件对于重叠延伸 PCR 反应，循环不宜过多，变性的温度也不宜过高，时间不宜过长。高温会使 DNA 受到损伤，造成 DNA 酶终止合成。考虑到DNA 聚合酶的扩增效率、错配率，每一轮反应的循环数控制在 20-25 个为宜。循环次数过多，碱基错配的几率增大；循环次数太少，则得不到足够的拷贝数进行下一轮反应。四条引物的TM值尽量保持相同或一致，利于引物的灵活使用。,片段中间引入突变,可以有目的地改变DNA序列中的碱基，从而阐明基因表达的调控机理，研究蛋白质结构与功能间的关系，改造天然蛋白质，使之更符合应用需求。突变点最好是位于引物的5端，尽量避免出现在3端,11,片段中间引入缺失,12,片段中间引入插入片段,13,片段拼接(如不同结构域DNA片段拼接),14,谢 谢,15,
