第七章电子显微镜免疫组织化学技术全解ppt课件.ppt

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1、第七章 免疫电镜,一 电镜免疫组织化学技术概述二 几种常用的透射电镜方法要点,一 电镜免疫组织化学技术概述,特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。,（一）组织固定与取材（二）免疫染色（三）包埋 （四）对照试验,（一）组织固定与取材,原则：既要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。固定： 固定剂的要求： 不损害细胞内抗原的活性； 固定速度快、效果好； 分子量小，易于渗透； 固定后,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。,影响固定的因素有： 固定剂的种类； 固定剂的浓度，浓

2、度过大，对抗原的活性有影响，浓度过小，固定效果差； 固定剂的pH； 固定剂的温度,一般采用24冷固定；这样能降低细胞自溶作用和水分抽提； 固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要快。不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致； 与被固定的细胞类型有关。,选用固定剂不宜过强。常采用灌注固定法。 多聚甲醛戊二醛混合液 过碘酸赖氨酸一多聚甲醛液(PLP液)： 对含糖类丰富的组织固定效果特佳。（使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的种类浓度、温度、pH及固定时间等。然后做出预处理的效价，作为失活参考以再选择最适条

3、件。）,取材：免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。,灌流后需续固定：四氧化锇,（二）免疫染色,包埋前染色 包埋后染色 超薄切片免疫染色,1 包埋前染色,即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修块；常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、树脂包埋。 特异性免疫反应的范围太小，可作二次包埋： 即第一次包埋时将组织置于两层塑料片之间，中夹环氧树脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。,包埋前染色的组织，以中层较为理想。 表层因受机械修整，结构保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。 半薄切片可在相差显微镜下不染色观察（PAP），免疫反应

4、部位呈黑点状； HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。 取相连续的超薄切片 为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，分别以两个铜网捞取，其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。,包埋前染色法的优点是： 切片染色前不经固定、脱水及包埋等过程，不破坏抗原。 在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检出率。适用含抗原量较少的组织。,2 包埋后染色（载网染色）,组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片； 免疫组化染色（载网染色）注意事项： 四氧化锇具有保存抗原的作用，但应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。后固定中一般以不用四氧化锇为佳，或尽量缩短在四氧

5、化锇中停留的时间。, 在载网染色过程中，铜网易与化学物质产生反应，故需选用镍网或金网。 在免疫组化处理的全过程中，应注意保持网面的湿润，网面干燥会影响抗体活性。,优点：超微结构保存较好，方法简便，阳性结果有高度的可重复性，还能在同一超薄切片上进行多重免疫染色。缺点： 抗原活性在样品处理过程中可能减弱甚至丧失； 环氧树脂中可与组织成份发生反应而改变抗原性质； 包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。,解决对策：去除包埋剂：饱和苯溶液，无水酒精中NaOH饱和溶液或乙氧化钠溶液等。去除四氧化锇：免疫染色前，将载网超薄切片以H202液蚀刻数分钟，以去锇和增强树脂的穿透性。,3 超薄冰冻切片,将组织置

6、于蔗糖保护液中，以液氮速冻；在冰冻超薄切片机上切片；免疫染色。 不需经固定、脱水、包埋等步骤，所以抗原性保存 较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。但技术条 件要求较高、难度较大。,（三）包埋,树脂包埋、低温包埋,1 树脂包埋 环氧树脂包埋法 直接脱水后包埋 原位包埋：将小片组织或半薄切片贴在载片上， 将充满环氧树脂的明胶囊倒置 于切片上聚合、硬化，进行包埋。,2 低温包埋,低温包埋剂：,（1）Lowicryls： 是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质，包括K4M、HM20、K1lM、KM23等系列产品。 特点： 是能在低温下保持低粘度； 具有在光照射下聚合的能力，光聚合作用与温度无关。,K4M和K

7、11M具有亲水性，能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色；HM20和HM23具疏水性，能产生高反差图像，适用于扫描、透射电镜和暗视野观察切片的制作。K4M应用较多,1）包埋剂的配制： 由三个部分组成：单体，交联剂和引发剂。 调整单体、交联剂比例，增加交联剂，可增加组织块的硬度。 中等硬度的组织块，其配制比例如下： K4M：单 体 17.30g 交联剂 2.70g 引发剂 0.10g 可用微量注射器加针头抽取后，注入棕色玻璃容器避光，用玻棒轻搅35 min或用一小管通入液氮气泡搅拌。勿过分搅拌，以防氧的气泡进入包埋剂中。,K4M 的应用,2) 生物样品处理程序 取材，以多聚甲醛一赖氨酸过碘酸

8、钠固定； 含7蔗糖PBS，冲洗过夜； 0.1 molLPBS， pH 7.2冲洗； 系列脱水；, 包埋： 新鲜K4M置于胶囊内，将组织块移入，在-30-40以紫外线灯照射24h使之聚合。如为100W灯泡，照射距离应大于85 cm。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射23天，可增加其硬度，便于切片。,3) 免疫染色 切片贴在金网或覆有碳膜的镍网上； 正常羊血清30 min； 稀释一抗，372h； 可用烧杯法(或塑料壶喷洗法)，以镊夹镍网在烧杯中洗荡； 正常羊血清30min。, 二抗以正常羊血清稀释，以镍网置于血清滴上孵育。 冲洗如。 覆于2OsO4水溶液上，30min。 冲洗如。 干燥后在电镜

9、下观察。 注意事项：所有步骤在室温、湿盒内进行；所有溶液需经微孔滤纸滤过。 Lowicryls 应保存在暗处，一4，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸汽刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部。,（2）LR white和LR gold 是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂； 具有极低粘度和较强嗜水性，穿透性强，有利于抗体(或抗原) 和免疫化学物质穿过LR树脂，达到组织结合部位； 在免疫细胞化学的光镜(半薄切片)和电镜水平应用都具有良好 效果。 标本脱水至70乙醇即可，能较好地保持抗原性。 生物样品处理与免疫染色等同常规树脂切片。,（3）GMA（乙二醇甲基丙

10、烯酸酯） 优点： 电子密度大； 影像反差好。 缺点： 包埋聚合后的组织块很脆，不易修整和切片。 聚合过程中易造成组织损伤如人为的细胞器肿胀。 缺乏稳定性，不能承受电子束轰击，包埋剂遇热升华，造成组织塌陷变形。故后来为环氧树脂所取代。,环氧树脂：有良好的塑料稳定性，能承受电子束的轰击不变形；影像反差好，分辨率高；半薄切片染色不够满意，效果不如GMA包埋切片的染色效果。,改进方法：增加一定比例的增塑剂如甲基丙烯酸丁脂和水、聚乙二醇400改变其硬度。使之变软；加入适量的交联剂乙烯二甲基丙烯酸酯以增强其抗电子束轰击的稳定性。选用低温型引发剂过氧化苯甲酰避免聚合时过快，产生高温，损伤组织结构。GMA已广

11、泛应用于半薄切片(13 um)的光镜观察，特别是组织化学方面的研究和电镜水平的免疫细胞化学技术。,1) 过滤: GMA单体溶液在出厂时都加有氢醌类稳定剂，用前须以每25ml单体溶液加一匙活性碳，在振荡器上振荡5 min，过滤以除去氢酯，以免影响聚合。 2) 包埋剂的配制： a. 100GMA N-甲基丙烯酸丁酯 66.5ml 5乙烯二甲丙烯酸酯 28.5ml 1.5过氧化苯甲酰 1.0g 1.0PEG 400 1.0ml,GMA包埋剂的配制、生物样品处理和电镜水平的免疫细胞化学染色方法：,bA液： GMA单体液 90ml PFG z300 59.4 ml 过氧化苯甲酰 0.20.69 g 搅拌

12、溶解后置棕色瓶内；4保存。 B液： PEG z400 20 ml 二甲基苯胺 1 ml 应用时A：B按10：1比例充分混。,3) 生物样品处理： 组织固定可用PLP液或1戊二醛溶液(磷酸缓冲液配制，Ph7.4)。经系列酒精脱水至新鲜的GMA单体溶液中浸24h。 以上步骤可在室温或4进行。,4) 包埋聚合： 组织移入盛满包埋液的胶囊内，放在真空泵内以去除包埋液中的气泡，然后在4，以紫外线灯(波长360nm)在距胶囊底部1020cm处进行照射1216h，以手指捏胶囊试其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，将胶囊丢人热水中以去除胶囊外壳。,5) 包埋后染色:切片贴在镍网上，按胶体金标记蛋白A技术（P

13、Ag法）进行包埋后染色，铀、铅双染后，电镜观察。 低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的 包埋后染色。能检出应用环氧树脂包埋难以检出的 多种抗原。,（四）对照试验: 略,免疫电镜技术存在的问题： 戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存，但对抗原活性有影响； H202能增加树脂穿透性，但对微细结构有损伤，能使反应部位产生孔洞。 染色中清洗工作不彻底，可产生非特异性产物和其他污染物，影响特异性反应产物的显示和观察。,二、几种常用的透射电镜方法要点,（一）铁蛋白标记免疫电镜技术 （二）过氧化物酶标记免疫电镜技术 （三）胶体金标记免疫电镜技术 （四）凝集素标记免疫电镜技术,（一）铁蛋白标记免疫

14、电镜技术,1 原理 铁蛋白：是一种含铁约占23的蛋白质，铁蛋白含有致密的铁离子核 心，含20003000个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密 区，具有很高的电子密度，便于电镜观察。 抗体与铁蛋白通过双功能试剂结合为一种双分子复合物。,此复合物保留了抗体的免疫活性，通过电镜可定位抗原。适于细胞表面抗原的定位 优点：铁蛋白易从马脾中获得，呈颗粒状，易分辨；缺点：分子量较大，不易穿透细胞膜和组织，对于细胞内抗原的定位较困难。只适合电镜检查，不能用普通光学显微镜观察。因此，在近年来逐渐被免疫酶和胶体金取代。,2 电镜标本的制备,（1）固定 同常规电镜（醛类和四氧化锇双固定） 铁蛋白标记抗体分子量

15、大，如用于细胞表面抗原的定位研究，可将样品直接放入固定液；细胞内抗原测定需：冻融法：固定后冻融使细胞膜破裂，标记抗体能进入细胞内。冰冻切片法：固定后速冻，切成10-15um薄片，融化的切片直接浸泡于铁蛋白标记的抗体液中。戊二醛固定后，浸入洋地黄皂甙液中1-2min，增强细胞膜穿透性，使标记抗体进入细胞内,冰冻超薄切片铁蛋白标记抗体免疫电镜图,艾滋病患者血清的免疫电镜所见。在病毒颗粒表面可见铁蛋白颗粒的吸附。,在细胞质的空泡内可见到大量的与细胞外所见相同的病毒颗粒。,培养的成纤维细胞质膜对LDL的内吞作用LDL颗粒与含铁的转铁蛋白共价相连， 电子显微镜下所见的黑点是小分子的铁。（a）LDL与细胞

16、表面的受体结合并形成有网格蛋白包被的小窝；（b） 含有LDL的被膜小窝向下凹陷逐渐形成被膜小泡；（c） 含有转铁蛋白标记的LDL被膜小泡；（d）含有转铁蛋白标记的LDL颗粒的无被小泡（初级内体）。,（2） 免疫染色方法 常采用包埋前免疫染色，分为直接法和间接法。 （1）直接法： 切片直接浸于标记的特异性抗体内，室温或3712h以上； 缓冲液浸漂，除去未结合的标记抗体溶液； 再按常规电镜后固定、脱水、包埋。,（2）间接法： 将切片浸入一抗室温孵育3060min； 大量冷缓冲液充分洗涤(330min)； 浸入铁蛋白标记二抗中，室温孵育30min； 充分洗涤后，可以自然沉淀或用离心方法捞取组织片；

17、将离心沉淀小块，用四氧化锇固定30分钟； 常规电镜脱水、包埋、切片、染色和观察。,（二）过氧化物酶标记免疫电镜技术,1 原理：利用酶作为抗原抗体复合物的标记物，再经酶对底物作用生成有较高电子密度的产物。HRP分子量小(40 000)，穿透力强，有利于标记抗体进入细胞内，适于细胞内的抗原定位。,2 方法（1）单层细胞培养物免疫酶染色法 用4%多聚甲醛原位固定1h; PBS充分洗涤，用HRP标记的抗体血清作用18h，再用PBS水洗； 2%戊二醛固定1h，再水洗； DAB显色 锇酸固定、树脂包埋，半薄切片定位后作超薄切片,（2）组织切片酶标记抗体染色法 1mm厚组织块，固定后如蔗糖保护液; 做10-

18、40um冰冻切片，放入一抗血清作用12-18h，用含蔗糖的PBS水洗； 置于HRP标记抗体液4 过夜，再水洗，浸漂过夜； 戊二醛再固定1h，用含蔗糖的PBS水洗； DAB显色； 锇酸固定、脱水、树脂包埋，切片复染和观察,HRP标记抗体，通过DAB呈色反应，DAB分解产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，经过Os04处理后变黑，具有高电子密度，适合于电镜观察；HRP分子量比铁蛋白将近小20倍，酶标抗体较易透过经适当处理后的组织细胞膜，能用于定位细胞内抗原。但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物高(如铁蛋白，胶体金)。,（3）包埋前PAP法：常用 固定组织； 振动切片机切3050um厚片； 入正常羊血清(5

19、10，PBS稀释)室温孵育30min。 加一抗，4湿盒中4872h。 加二抗，室温孵育30min。 PAP复合物(与一抗同种属动物制备)室温孵育30min。 H2O2DAB，室温作用15min。 光镜下选出阳性部位，修整后按常规电镜程序，四氧化 锇后固定、脱水、包埋、超薄切片、观察。,（4）包埋后PAP法： 载有超薄切片的镍网入5H2O2液内蚀刻，生理盐水洗， 滤纸吸干。 5正常羊血清，室温5min。 加一抗)，4孵育48h，TBS洗。 5正常羊血清，室温5min。 加二抗室温5min，后用TBS洗。 5正常羊血清，室温5min。 加PAP复合物室温3min。 H2O2一DAB显色，室温3mi

20、n。 入1四氧化锇液1015min后，蒸馏水洗，电镜观察。（5）PAP免疫电镜双重标记：连续超薄切片上进行，用包埋后染色法在相邻的两张切片上分别以不同的抗体进行免疫染色。可在超微结构水平判定细胞内抗原共存的情况。,（三）胶体金标记免疫电镜技术,1971年首创胶体金标记免疫电镜技术。胶体金在碱性环境中带负电，使其与抗体相吸附，从而标记抗体；金标抗体与抗原反应时，在光镜胶体金液呈樱红色，不需另外染色；电镜下，胶体金颗粒，具有高电子密度，清晰可辨；在电镜比铁蛋白颗粒更致密，易于辨认，可代替铁蛋白作为扫描免疫电镜的标记物；定位比酶反应物精确。胶体金容易和多种大分子物质、包括抗体、A蛋白、凝集素等结合。

21、根据制备方法不同，可以得到直径在3-150nm之间的各种大小的胶体金颗粒；分别使用不同直径的胶体金颗粒制备标记物，可以在同-标本片上显示两种或多种抗原物质，即所谓双标记或多标记。,原理： 胶体金是表面带负电荷的疏水性颗粒，可与抗体相吸附，从而标记抗体。用金标记的抗体与抗原反应时，光镜观察呈樱红色。由于金颗粒具有很高的电子密度，电镜观察清晰可辨。,金颗粒可分为三种，小颗粒直径35nm，中颗粒10nm，大颗粒20nm。胶体金可标记许多大分子，最常用的是蛋白A一金和Ig一金。可以利用不同直径的金颗粒标记不同抗体研究不同物质共存于同一细胞组织；也可以与PAP法相结合进行双重或多重超微结构定位。,方法：

22、1 电镜水平的免疫金染色法包埋前染色：胶体金对质膜的穿透力较差，只用于细胞表面的抗原标记。包埋后染色：现在普遍采用。（1）包埋后染色：超薄切片置于镍网上 1H2O2液内蚀刻，双蒸水洗涤3次浮于正常羊血清滴上，室温30-60min；孵育于一抗上， ，4过夜，PBS水洗；PBS（内含1%的牛血清白蛋白）PH8.2，5min，为胶体金结合做准备；胶体金标记抗体液，室温孵育10min-1h，双蒸水洗涤；如做双重染色，则应将镍网翻过来，用另一类抗体血清，重复上述步骤；醋酸铀染色5min，双蒸水洗涤，枸橼酸铀染色5min，双蒸水洗涤；电镜观察,（2）包埋前染色：组织经适当固定，为增强细胞穿透力，可在固定液

23、中加入皂角素；TBS洗涤；正常羊血清处理；一抗孵育， 4过夜，0.05mol/L TBS水洗； 0.02mol/L TBS水洗，为胶体金结合做准备；正常羊血清再次阻断非特异性吸附； 金标二抗体液，室温孵育1h，TBS水洗；1%锇酸1h，双蒸水洗15min；系列酒精或丙酮脱水、包埋、超薄切片；枸橼酸铅对照染色,2 胶体金标记蛋白A技术（PAg法）,在免疫电镜中应用较为广泛。PAg复合物制备方法简便，作为第二抗体，无种属特异性；PAg复合物与包埋剂和细胞成分都极少发生非特异性交互作用，蛋白A与金粒间非共价的结合特性既不影响蛋白A的活性，又能保持高度的稳定性；PAg复合物分子小，易于穿透组织。3 胶

24、体金双标记技术（1）单面法：以不同直径的金粒分别标记两种不同抗体；（2）双面法：以不同直径的金粒标记的抗体与镍网的两面分别进行染色；（3）异种动物抗原-抗体染色法：（4）金标记抗原检查法,免疫电镜：寻常型天疱疮血清见金颗粒沉积在桥粒复合体上,在非桥部位的角质形成细胞间未见特异性金颗粒沉积(50000),低温包埋剂包埋后免疫胶体金电镜图(箭头所示球内系膜蛋白沉积),优点： 金标记法程序较PAP法简单，不用H202作底物以显色，减少了对超微结构的损伤。 金标记法还可用于扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。 胶体金标记蛋白A作为第二抗体，无种属特异性， 特异性强、灵敏度高、方法简便、背景

25、清晰，目前应用较广。4 免疫电镜金银法染色技术： 一般用于包埋前染色,（四）凝集素标记免疫电镜技术,凝集素是一类从各种植物种子和动物组织中提取的糖蛋白或结合糖的蛋白。因其能凝集红细胞，故名凝集素，亦称外源凝集素。常用的为植物凝集素。已纯化并鉴定的植物凝集素有近100种。能识别糖蛋白和糖脂中，特别是细胞膜表面的糖基。一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力。可以作为研究细胞膜结构的探针。凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合、而不影响其生物活性，可用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究工作，在探索细胞分化、增生和恶变的生物学演变过程，显示肿瘤相关抗原物质，以及对肿瘤的诊断评价等方面均有一定的价值。,