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1、,荧光偏振免疫分析,-by沈未,荧光偏振(fluorescence polarization, FP)通常定义为:用垂直方向(丄)的偏振光激发荧光分子,然后测量发射偏振光在垂直方向(丄)和水平方向(丨)的荧光光强度(丨)早期的荧光偏振研究均以P表示,目前其仍常用于临床化学和药物筛选;而A多生物学检测,是因其便于进行数据分析和解释某些相关的物理学参数。,FP值是一个比值,一般以mP表示(1P=1000mP)。分子固定不动,即完全偏振时,FP值是P0=1000 mP,是理论上的最大值;在一个分子可以自由运动的系统中,根据分子运动速度的快慢,荧光偏振值大约在0 500 mP之间.,论文的结构和主要内
2、容,如果待测样本中竞争抗原含量很少(低于检测限),荧光标记抗原与抗体结合,FP值较高(一般在150-300 mP)。而待测样本中竞争抗原的浓度增加时,荧光标记抗原以游离的形式存在于样本中,FP值便会下降,一般在30-60 mP即为完全抑制,FPIA是均相的竞争免疫分析方法,反应完全在溶液系统中,不需要分离结合的和未结合的抗体。实验操作过程非常简单,仅仅是将抗体,荧光标记的抗原和抗原加入到反应杯中,经过几分钟甚至是几秒钟的温育便可直接测量,很快得到被测抗原的浓度。,组蛋白对DNA荧光偏振度影响,1. 制备DNA-组蛋白复合体:-DNA(48kbp)用荧光染料YOYO-1标记, 碱基对与染料分子之
3、比为10:1;用 Bis-Tris缓冲液(50mmol/L, pH6.6)稀释组蛋白溶液; 组蛋白浓度是DNA的10500倍;DNA/YOYO-1溶液(6.5 pmol/L)和稀释后的组蛋白溶液共同保温(37)培育3h, 反应液体积为2mL;,组蛋白对DNA荧光偏振度影响,2.荧光偏振度测量:用MOS-450/CD测量,其是一个标准的荧光偏振度测量模式;在测量荧光偏振度时, 偏振光弹性调制器自动设置在半波长模式, 这样激发光在水平分量和垂直分量之间以100 kHz 的频率转换;应用Bio-Kine 软件(Bio-Logic)通过两个散射信号实时计算荧光强度和荧光偏振度;,组蛋白对DNA荧光偏振
4、度影响,3. DNA-组蛋白复合体荧光偏振度随组蛋白与DNA 浓度比变化关系曲线,组蛋白对DNA荧光偏振度影响,4. 对图表的解释:在溶液中单独存在时, DNA分子随机卷曲且有弹性此构型对应着一定的偏振度值.在我们的实验条件下, DNA 分子的荧光偏振度在0.11左右;在组蛋白的作用下，DNA分子发生了凝聚;DNA-组蛋白分子可能呈现更紧密、更小的构型, 导致复合体分子比 DNA 分子旋转更快, 对应较小的荧光偏振度值;,荧光偏振研究的一般步骤,1.确定最佳的荧光标记物;2.确定公式中的各种参数;3.倍比稀释结合物，根据不同的FP值确定最优稀释比，使其结合能力与FP值成线性关系;4.建立标准曲
5、线;5.分析结果,验证实验猜想。,荧光偏振免疫分析的优点,1.均相系统,不需要洗涤操作,可大大减少试剂的用量。2.检测速度很快,且易于自动化,适于快速的筛选检测。3.荧光标记抗原的均一性好,性质稳定,可长期保存,方法的重现性好。4.FP值是一个比值,与其他荧光检测技术相比,不易受溶液颜色和仪器灵敏度变化的影响，实验结果稳定,可靠性高。5.选用不同发射波长的荧光素来进行多标记检测,可实现多目标物的同时定性及定量分析。如四甲基罗丹明,其激发和发射光谱与荧光素的重叠很少,因此相互之间基本不会干扰,现已在多标记检测中得到应用。,荧光偏振免疫分析的缺点,1. FPIA比ELISA方法的灵敏度低。一般来说
6、FPIA的检测限为0.1-10ng/mL-1左右。2.FPIA易受样本基质(如与基质蛋白的非特异性结合),背景荧光和光散射的影响。3.FPIA的检测信号的背景较高,检测范围(窗口)较窄,信噪比(S/N)较低。4. FPIA对荧光标记物的纯度要求较高,需耍较复杂的纯化步骤。5. FPIA检测需要特定的分析仪器,或对普通的荧光分光光度计增加测量偏振附件。因此价格较普通酶标仪昂贵。,对本实验室研究的思考,当研究对象为与核酸(DNA/RNA)互作的蛋白时，可以在核酸的末端加上一个荧光标签,研究二者之间的结合关系,包括结合常数,动力学参数等等。,推而广之，还通过核酸等小分子研究蛋白-蛋白复合物之间的结合。,
