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1、,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,药品微生物限度与无菌检查,风险管理 风险调查/评估,微生物实验室技术能力,药品微生物控制,风险管理、风险调查/评估,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,药品微生物检验的过程控制,环境保证,培养基保证,无菌性检查,灵敏度检查,有效的方法,方法验证,SOP操作,有效的结果,可靠的结论,结果判断,过程控制,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,Luzhou Institutes for Food and Dru
2、g Control,药品微生物检验的过程控制,环境保证,培养基保证,无菌性检查,灵敏度检查,有效的方法,方法验证,SOP操作,有效的结果,可靠的结论,结果判断,无菌检查用隔离系 统验证指导原则,药品微生物实验室 质量管理指导原则,药品洁净实验室微生物 检测和控制指导原则,微生物鉴定 指导原则,药品微生物检验替代 方法验证指导原则,对照培养基,al Institutes for Food and Drug Control,案例,阳性结果与玻璃安瓿表面采样菌高度相似,Nation,Luzhou Institutes for Food and Dr,无菌检查过程微生物控制, 空气微生物 浮游菌 沉降
3、菌, 表面微生物 样品包装表面 操作人员手部,易折方式影响折断力 色环：通过在瓶颈喷涂与玻 璃膨胀系数不同的色釉产生 应力，从而使断面平整灌装工艺落后造成折断 力差为防止灌装中安瓿断头安瓿折断后，断面应平整。Luzhou Institutes for Food and Drug Control国家药用包装容器（材料）标准YBB00332002,点刻痕易折玻璃安瓿,点刻痕易折安瓿的色点应标记在刻痕的上方中心 与中心线的偏差不得过1.0mm,刻痕工艺控制不好 深浅、长短、高低位置不一 色点和刻痕位置偏离规格尺寸不规范 瓶身外径精度不够 刻痕不易控制 瓶颈壁厚不均匀 折断后断面不平整,玻璃材质不佳
4、低硼硅玻璃：48.6% 中性硼硅玻璃：7.7% 我国90%以上低硼硅玻璃,玻璃安瓿表面消毒方案比较,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,杀孢子剂（过氧乙酸）喷洒后立即（3min、5min、10min）用 75%乙醇钝化，再用湿棉签擦拭取样酒精灯过火1秒钟（3秒钟、5秒钟、10秒钟）后直接用湿棉签 擦拭取样,微生物检验的过程控制,环境保证,培养基保证,无菌性检查,灵敏度检查,有效的方法,方法验证,SOP操作,有效的结果,可靠的结论,结果判断,过程控制,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,微生物
5、实验室工作流程,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,环境保障,WHO GPML 各区域等级,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,微生物限度 & 无菌检查环境要求,无菌检查：环境洁净度B级背景下的局部A级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中B+Aor隔离系统,中国药典2010版 万级下的百级,中国药典2015版 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则无菌检查用隔离系统验证指导原则,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,9205,9206,微生物
6、限度检查：受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内D+BSC生物安全柜,洁净室/台工作原理,层流 Laminar flow,混流Conventional (mixed flow) cleanroom,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,相关洁净标准比较,ISO 14644讨论了洁净室和受控环境的设计与建设按ISO 14644的分类是建立在环境中每单位体积的总体粒子数的基础上,分类不区分非生物粒子或生物粒子,相关洁净标准比较,2010版GMP洁
7、净度级别标准,“静态”百级，“动态”万级,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,相关洁净标准比较,2015版 建议的洁净实验室环境监测频次及项目,按ISO 14644的定级是建立在环境中每单位体积的总体粒子数的基础上,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,定级不区分非生物粒子或生物粒子,Luzhou Institutes for Food and Drug C,“B级”与“C级”的异同,ontrol,悬浮粒子与环境微生物,Luzhou Institutes for Food and Drug C
8、ontrol,非生物粒子数量和活的微生物浓度之间的关系在科学 上未达成绝对的一致当操作人员是粒子的来源时，以下的结论是成立的， 即洁净室中的粒子越少，空气中微生物存在的可能性就 越小。实验设备运行时大量产生的粒子污染和人员产生的粒子污染之间是无法明确区分的大量的药物除了微生物以外还有粒子限度的要求几乎肯定的是，部分悬浮粒子与微生物有关因此，洁净室监测应包括微生物与粒子数两方面,洁净室使用次数与浮游菌数关系,416#浮游菌数201月2月3月4月5月6月7月8月9月10月 11月 12月,6,8,10,161412,13#使用次数,13#浮游菌数,16#使用次数,Luzhou Institutes
9、 for Food and Drug Control,近8年无菌室C级浮游菌高限图,9080706050403020100,2007,2008,2009,2010,2011,2012,2013,2014,7月8月9月,硬件差异,软件差异,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,洁净区微生物监测水平,USP3515 cfu 信息性， 非标准性,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,监控基于风险评估,120100806040200,法规标准 OOT行动限 OOE警戒限 常规波动,WHO good pr
10、actices for pharmaceutical microbiology laboratoriesAppendix 4Examples of equipment qualification and monitoring,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,环境微生物归属,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,Luzhou Ins,titutes for Food and Drug Control,欣弗事件,欣弗培养物,洁净环境常见菌： 头状葡萄球菌（Staphylococcus capi
11、tis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 缓症链球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii） 藤黄微球菌（Micrococcus luteus） 山羊葡萄球菌（Staphylococcus caprae）,肺炎克雷伯,巨大芽孢杆菌,粘质沙雷菌,夺命的欣弗,不同生物安全水平对设施的要求,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,不同保护类型及生物安全柜的选择,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,I级
12、安全柜适用于一级，二级和三级安全实验室， II级和III级安全柜则适用于所有级别安全实验室。,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,Class I 生物安全柜,适用于样品不需保护的工作1、从前窗口吸入的负压气流，用以保护人员的安全； 2、排出的气流经HEPA过滤器过 滤，用以保护环境，不受污染； 3、对受试样本，不能提供切实 可靠的保护。,无外接风道有外接风道Contaminated air under negative pressure Contaminated air under positive pressureHEPA-filtered
13、 airRoom airLuzhou Institutes for Food and Drug Control,II级A2型生物安全柜,前窗进风气流平均流速0.50m/s 生物安全柜排风管道接口 与建筑物排风系统相连接 可以从事少量的的挥发性 有毒化学物质或放射性的 工作。,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,在生物安全柜上工作,干净的物品,工作台摆放,被污染的区域,废弃物托盘,垃圾袋,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,无菌隔离系统与传统洁净技术的对比,Luzhou Institutes
14、for Food and Drug Control,Na,隔离器,2x3-glove Isotest,H2O2溶液被泵入蒸发器 液态H2O2 气态H2O2,10 SAL表面杀灭效率,-6,tional Institutes for Food and Drug Control,隔离器,9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则,1.操作验证3.灭菌验证4.灭菌循环验证,2.完整性验证,5.内部洁净度验证6.仪器仪表验证,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,Luzhou Institutes for,Food and Drug Control,三种
15、主要设备比较,微生物检验的过程控制,环境保证,培养基保证,无菌性检查,灵敏度检查,有效的方法,方法验证,SOP操作,有效的结果,可靠的结论,结果判断,过程控制,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,ChP无菌检查培养基与USP、BP的比较,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,硫乙醇酸盐流体培养基（Fluid Thioglycollate Medium）,ChP无菌检查培养基与USP、BP的比较,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,大豆胰酪胨培
16、养基(TSB) & 改良马丁培养基,微生物实验室常用菌株,铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B) 10104大肠埃希菌（Escherichia coli） CMCC(B) 44102金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)CMCC(B) 26003生孢梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64941,枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)G+芽孢杆菌 CMCC(B) 63501,G-杆菌,G+球菌,酵母菌,霉菌,兼性需氧菌,专性厌氧菌,专性需氧菌,白色念珠菌 (Candida albican
17、s)CMCC(F) 98001黑曲霉 (Aspergillus niger) CMCC(F) 98003,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,在硫乙中生长差异,仅 在 厌 氧 层 生 长,需 氧 层 厌 氧 层 均 生 长铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),仅 在 需 氧 层 生 长,CMCC(B) 10104大肠埃希菌（Escherichia coli） CMCC(B) 44102,金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus
18、 aureus) CMCC(B) 26003,生孢梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64941,枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) CMCC(B) 63501,方法适用性内容修订,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,微生物计数定义变化,对照培养基,培养基质量控制： USP之前验证过的 中国药典对照培养基,单剂量免称量独立包装 专利号： ZL200920108836.8,回收率 待测培养基平均菌落数（cf
19、u ）*100%对照培养基平均菌落数（cfu）,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,50%200%,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,培养基适用性检查,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,培养基适用性检查,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,培养基适用性检查,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,培养基适用性检查,Luzhou Insti
20、tutes for Food and Drug Control,培养基适用性检查,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,样品：乌鸡白凤丸,乌鸡白凤丸,胰酪大豆胨琼脂培养基,玫瑰红钠琼脂培养基,疑似菌落做革兰染色 革兰阳性杆菌 不属于霉菌或酵母菌。,将无菌硫酸庆大霉素（相当于20mg庆大霉素）胰酪胨大豆琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基。,Luzhou Institutes for Food and D,rug Control,选择性培养基适用性,Luzhou Institutes for Food and D,rug Control,选择性培养基适
21、用性,微生物检验的过程控制,环境保证,培养基保证,无菌性检查,灵敏度检查,有效的方法,方法验证,SOP操作,有效的结果,可靠的结论,结果判断,过程控制,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,检测方法验证,标准（药典）检测方法实验室在进行常规检测前应证明该实验室可以满足标准检测方法 中的某些性能指标（即方法确认），并证明某一方法适用于某产 品的检测（方法适用性包括阳性对照和阴性对照）。新建方法方法验证与方法适用性,药典方法（其他成熟方法）,方法转移与方法确认（部分菌株的验证）,有案可查、溯源性 ； 建立实验室自身的方法依据体系其他准确度、精密度、
22、专属性、检测限、定量限、线性、粗放性,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,验证的一般程序与环节,需前处理,不需前处理,无抑菌作用,样品,检查,验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。,验证抑菌活性去除的有 效性，以及去除方法对污 染菌生长、检出的影响。,可以通过验 证实验判断,药品微生物检查方法验证的一般程序与环节,利用供试品与微生物的差异，降低或消除供试品的影响 通过模拟实验对降低或消除效果加以检验。,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,吐温80结构,乳化剂降低了混合体系中各组分的界 面张
23、力，并在微滴表面形成较坚固的 薄膜由于乳化剂给出的电荷而在微滴表面 形成双电层，阻止微滴彼此聚集，而 保持均匀的乳状液。,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,分装5份 9.9ml供试液,+ 0.1ml金黄色葡萄球菌液,+ 0.1ml金黄色葡萄球菌液,+ 0.1ml金黄色葡萄球菌液,+ 0.1ml铜绿假单胞菌液,+ 0.1ml枯草芽孢杆菌液,+ 0.1ml白色念珠菌液,+ 0+.01m.1lm黑l黑曲曲霉霉菌菌液液,+ 0.1ml铜绿假单胞菌液,+ 0.1ml金黄色葡萄球菌液,+ 0.1ml铜绿假单胞菌液,+ 0.1ml枯草芽孢杆菌液,+ 0.
24、1ml金黄色葡萄球菌液,+ 0.1ml铜绿假单胞菌液,+ +00.1.1mml白l白色色念念珠珠菌菌液液,+ 00.11mmll枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌液液,+00.1.m1mll金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌液液,+ 00.11mmll铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌液液,根据供试品的理化 特性与生物学特性，采取适宜的方法制备合适的供试液。,稀释度依据样品特 性，质量标准制定,计数方法适用性试验,保证平皿中的菌数不大于100cfu,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,微生物检验的过程控制,环境保证,培养基保证,无菌性检查,灵敏度检查,有效的方法,方法
25、验证,SOP操作,有效的结果,可靠的结论,结果判断,过程控制,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,微生物限度案例,某板蓝根冲剂，标准为细菌数不得过1000cfu/g，某药检所细菌数 结论1200cfu/g，送中检院仲裁。(1)方法适用性,合格,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,不合格,Luzhou Institute,Drug Control,菌种传代保藏流程,1 BioBall3 推荐方式2 自动稀释,s for Food and,Luzhou Institutes for Food a
26、nd Drug Control,试验用菌株的传代次数不得超 过5代（从菌种保存中心获得的冷 冻干燥菌种为第0 代）。代的定义：每接种一次即为一 代（有在新鲜的培养基上生长过程) 传代示意图：干燥菌种（0代）,QC,CV1CV2CV3液体培养基复苏（1代）,工作菌株传代保藏规程,菌种传代流程,S1S2, S3,QC,S1,S2,S3 ,第二代工作菌悬液,冷藏（零下20）,cv1 CV,cv2, cv3,cv4,QC,Cycle 1第一代储备管 冻存（零下30或70 ）,冻干菌种,第二代工作菌斜面冷藏（28）, ,鉴别,cv11,cv2,cv3,cv36,Cycle 2第二代储备管冻存（零下30或
27、70 ）QC,TSB,QC,工作菌株传代保藏流程示意图,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,。,微生物检验的过程控制,环境保证,培养基保证,无菌性检查,灵敏度检查,有效的方法,方法验证,SOP操作,有效的结果,可靠的结论,结果判断,过程控制,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,实验操作 物料进场,消毒液搽拭 物品外表面,洁净传递（风淋、紫外照射）核心区外围消毒剂清洁外表面,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,双层无菌包装,外围,实验操作 人
28、员进场,一更,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,二更,Luzhou Institutes for,Food and Drug Control,硫乙 阴性 090423,马丁 阴性 090423,马丁样品 090423,硫乙样品 090423,马丁阳性 090423,硫乙阳性 090423,监控平板,样品沉降菌手指,无菌检验框架示意图,Luzhou Institutes for,无菌三针单联管,Food and Drug Control,实验过程监控,表面监控,手部监控环境菌监控,Luzhou Institutes for Food and
29、Drug Control,无菌程序保障,无菌检查样品前处理分批消毒、实验（混合） 统一消毒，统一实验严格遵守外表面消毒程序一般环境酚类 （phenylphenol/ tertiary amylphenol ） 洁净环境过氧乙酸+75%乙醇（无菌级）（苯式苯酚/三级戊基苯酚）增加过程监控力度 表面菌采样、手部采样（每批）、动态浮游菌采样（下风口）,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,Luzhou Institutes for,Food a,nd Drug Control,明确标识,Paper labels are preferredover m
30、arker pens.,原始记录,样品信息&方法信息,仪器信息&状态检验结论前置 方便核验,校对&复核信息前置,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,原始记录,样品信息一致材料信息&试剂信息,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,检验方法描述,检验结果记录,原始记录,样品信息一致过程监控信息包括监控方案培养条件 培养结果 及培养基信息,是否启动偏差调查记录,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,原始记录,样品信息 环境保障调查仪器运转 环境监控检
31、验操作调查 培养基、检验用具 阴性、阳性对照 操作细节,结果判断调查,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,微生物检验的过程控制,环境保证,培养基保证,无菌性检查,灵敏度检查,有效的方法,方法验证,SOP操作,有效的结果,可靠的结论,结果判断,过程控制,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,结果判断,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,阳性（+）阴性（-） 供试品管浑浊，即判不合格 除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非 供试品所含 设备
32、，环境的微生物监控结果超标 回顾实验过程，发现污染因素 鉴定微生物，确认是操作引入的无菌试验经确认无效，可重试,药品无菌检验的溯源性分析,药品微生物实验室,环境/过程微生物的监测,药品的微生物检测,环境/过程细菌与药品 细菌的比较,结论,产品污染,实验污染,污染源排除,重试,溯源分析,整改,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,药品微生物实验,环境微生物 的监测,药品的微生 物检测,环境微生物与阳性结果的比较,结论,保证药品微生物检验结果可靠的有效途径,过程微生物信息的全面性,微生物鉴定结果的准确性,Luzhou Institutes for
33、Food and Drug Control,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,各类常见微生物的菌落特征,微生物类别菌落特征,单细胞微生物,菌丝状微生物,细菌,酵母菌,放线菌,霉菌,主 要 特 征,细 胞,形态特征,小而均匀、 个别有芽孢,大而分化,细而均匀,粗而分化,相互关系,单个分散或按 一定方式排列,单个分散或 假丝状,丝状交织,丝状交织,菌 落,含水情况,很湿或较湿,较湿,干燥或较干燥,干燥,外观特征,小而突起 或大而平坦,大而突起,小而紧密,大而疏松 或大而致密,参 考 特 征,细胞生长速度,一般很快,较快,慢,一般较快,气味,一般
34、有臭味,多带酒香,常有泥腥味,霉味,革兰染色,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,Food and Drug Control,第一步：结晶紫使菌体着上紫色第二步：碘和结晶紫形成脂溶性大分子复合物， 分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同， 出现不同的反应。第四步：番红复染，增加脱色菌与背景的反差 并区别于未脱色菌。G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色 时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。 呈紫色。G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其 脂含量高,乙醇
35、将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞 壁，番红复染后呈红色。,革兰染色原理,Luzhou Institutes for,实验室常用细菌革兰染色结果,G-杆菌 代表菌种： 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)大肠埃希菌（Escherichia coli）,G+芽孢杆菌 代表菌种： 枯草杆菌(Bacillus subtilis),G+球菌 代表菌种： 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),Luzhou Institutes for Food and Drug Control,KOH拉丝试验,原理：革兰阴性细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于 破裂，释
36、放出未断裂的DNA螺旋，使氢氧化钾菌悬 液呈现粘性，可用接种环搅拌后拉出粘丝来，而 革兰阳性细菌在稀碱溶液中没有上述变化。方法：取1滴40g/L氢氧化钾水溶液（应新鲜配制）于洁净玻片上，取新鲜菌落少许，与氢氧化钾 水溶液搅拌混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观 察能否拉出粘丝。用接种环拉出粘丝者为阳性，仍为混悬液者为阴 性。主要用于革兰阴性菌与易脱色的革兰阳性菌的鉴别。大多数革兰阴性菌于510s内 出现阳性反应，有的则需3045s，假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、莫 拉菌等大多数在10s内呈阳性，不动杆菌、莫拉菌反应较慢，大多数菌株在60s内 出现阳性，而革兰阳性菌在60s以后仍为阴性。,L
37、uzhou Institutes for Food and Drug Control,细菌鉴定技术, 营养物质代谢试验 碳源和氮源利用试验 各种酶类试验API试验条 各种自动鉴定系统,表型鉴定,16SrRNA分型 核糖体分型 脉冲场电泳,基因型鉴定, 傅里叶变换红外技术,色谱光谱,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,表观生物学活性,核酸物质,全细胞信息,细菌的鉴定流程,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,基因型鉴定的局限性,Luzhou Institutes for Food and Dru
38、g Control,鉴定系统同样不能鉴定所有的微生物需要昂贵的分析设备及耗材通常仅有关键的微生物调查才会应用仅凭基因型数据作出的决定，对于考虑微生物特征，测试历史及微生物来源，是没有意义的 当今伯杰氏手册中的分类学手段基于遗传物质并非 遵循表观水平，导致一些已知的微生物分类学发生 改变及重命名。（黑曲霉ATCC16404）,药品微生物实验室微生物鉴定宗旨,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,通过整合，使用多层面的信息，如微生物特征确定，表型及基因型数据，及微生物来源，将多相分类 学的概念应用于微生物鉴定建立内部数据库，忠实记录鉴定结论无论哪种方式，在确认过程中，应根据供应商或药 典的建议，使用适当的质控菌株,总结,药品微生物检查的过程控制环境保障 培养基保障 操作保障,针对微生物结果的溯源性调查过程微生物信息的全面性微生物鉴定结果的准确性,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,Luzhou Institutes for Food and Drug Control,谢谢各位同仁各位朋友各位领导,有问题可以加QQ讨论,12673859,
