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1、第九章 吸光光度法,Chapter 9 Spectrophotometry,吸光/分光光度法 是基于物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长不同，可分为比色法、可见分光光度法、紫外分光光度法及红外分光光度法。,根据试样颜色深浅的程度与已知标准溶液比较来确定物质含量的方法称为比色法。 用分光光度计进行比色分析的方法称为吸光/分光光度法。,化学分析与光度分析方法比较,光度法 ： 结果0.048%0.052%, 满足要求,容量法： V(K2Cr2O7 ,浓度1.6x10-3mol/L)0.02mL, 测不准,重量法： m(Fe2O3)0.14mg, 称不准,例: 含Fe约0.
2、05%的样品, 称0.2g, 则 m(Fe)0.1mg,光度分析：微量组分(10-310-6), 相对误差2%5% 依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器,化学分析：常量组分(1%),相对误差 0.1%0.2% 依据化学反应, 使用玻璃仪器,准确度高,灵敏度高,分光光度法的特点：1 灵敏度高。检测下限可达105106 mol/L，适用于微量分析；2 比色法相对误差510； 分光光度法相对误差25 （满足微量要求） 3 操作简便、检测快速；4 应用广泛，几乎所有无机物和多数有机物均可检测。,10nm200nm,200nm 380nm,380nm 780nm,780 nm 2.5 m,2.5 m
3、 50 m,50 m 300 m,光学光谱区,物质的颜色与光的关系,单色光: 只具有一种波长的光。混合光: 由两种以上波长组成的光。白光:由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种 单色光按一定比例混合而成。,光的互补:两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。,4,物质的颜色:物质对不同波长的光具有选择性吸收作用。 吸收光在可见光区,吸收光与透过光的颜色为互补关系,物质呈现透过光的颜色。CuSO4溶液：吸收白光中的黄色光而呈蓝色；KMnO4溶液：吸收白光中的绿色光而呈紫色。 如吸收光在紫外区，则物质不呈现颜色。,光的互补性与物质的颜色,91 吸
4、光光度法的基本原理,一 物质对光的选择性吸收,溶液对光的作用示意图,I0,吸收后 I,分子、原子、离子具有不连续的量子化能级 当照射光子的能量hv与被照射粒子的基态和激发态的能级差 E=E激 E基 hv =hc/ 相等时才能发生吸收。不同物质微粒的结构不同，量子化能级的能量差E也不同， 则 也不同，因此物质对光的吸收具有选择性选择性：不同物质对特定波长的光具有最大吸收。,物质对光的选择性吸收的原因,吸收曲线: 将不同波长的光通过某一固定浓度和厚度的有色溶液,测量每一波长下的吸光度横坐标：波长纵坐标：吸光度A 作图,即可得一曲线.这种曲线描述了物质对不同波长光的吸收能力,称吸收曲线。,，邻二氮杂
5、菲亚铁溶液的吸收曲线,吸收光谱或吸收曲线,KMnO4溶液对波长525nm附近的绿色光吸收最强，而对紫色光吸收最弱。光吸收程度最大处的波长叫做最大吸收波长，用max表示。不同浓度的KMnO4溶液所得的吸收曲线都相似。,KMnO4溶液的吸收曲线(cKMnO4:abcd),苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱 形状及max均不同,吸收光谱或吸收曲线,定性分析基础 不同的物质，其吸收曲线形状和最大吸收波长各不相同，可对物质进行定性分析。定量分析基础 不同浓度的同一物质，其max不变，在吸收峰及附近处，吸光度随浓度增大而增大，呈一定比例关系。可对物质进行定量分析。,KMnO4溶液的吸收曲线(cKMnO4:abc
6、d),吸收曲线说明(1)物质呈现颜色是由于对光的选择性吸收(2)是选择测定波长的重要依据（max）(3)物质一定时，随浓度增大，吸光度也增大，但最大吸收波长max不变。,二 光吸收基本定律 朗伯比尔（Larnbert-Beer）定律,三、光的吸收定律朗伯-比尔定律,1.朗伯定律（1760年）吸光度A与液层厚度b的关系,2.比尔定律（1852年）吸光度A与物质浓度c的关系,1.朗伯定律： A = kb,1倍浓度,2倍浓度,2.比尔定律：A=k”c,式中 A：吸光度（无量纲单位） I0: 入射光强度 I: 透射光强度 a：吸收系数，单位 Lg-cm- b: 液层厚度，单位通常为 cm c：溶液的浓
7、度，单位 gL-,光吸收定律朗伯比尔定律的数学表达式 ,式中：摩尔吸收系数 ，单位 Lmol-cm-； b：液层厚度，以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位 molL-； a 与 的关系为： = M a （M为摩尔质量）,朗伯比尔定律的另一数学表达式 ,摩尔吸收系数 的含义当c的单位用molL-1表示时A bc 的单位: Lmol -1cm -1 在数值上等于浓度为1mol/L的吸光物质在厚度为1cm光程中的吸光度A，是物质吸光能力大小的量度。 值越大，测定方法越灵敏。 通常在104以上时，认为方法灵敏，准确。,描述入射光透过溶液的程度 T = I / I0吸光度A与透光度T 的关系:,(1
8、) 朗伯-比尔定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。(2) 吸光度具有加和性。,透光度T （百分透光度 T %),吸光度与透光率的关系,例9-1 浓度为25.0 g / 50mL的Cu2+溶液，用双环已酮草酰二腙分光光度法测定，于波长600nm处，用2.0cm比色皿测得T=50.1%，求吸光系数a和摩尔吸光系数 。已知M(Cu)=64.0。,解 已知T=0.501，则A=lgT=0.300，b=2.0cm,则根据朗伯比尔定律 A=abc，而= Ma = 64.0gmol-13.00102 Lg-1cm-1 =1.92104(Lmol-1cm-1),例9-2 某有色溶液，当用1cm比色皿时
9、，其透光度为T，若改用2cm比色皿，则透光度应为多少？解: 由A= - lgT=abc可得 T=10-abc 当b1=1cm时，T1=10-ac=T 当b2=2cm时，T2=10-2ac=T 2,三 偏离朗伯比尔定律的原因,实验中，工作曲线经常偏离线性而弯曲。偏离原因（）非单色光引起（）溶液因素引起（ 3）化学因素引起,朗伯一比尔定律只对一定波长的单色光才能成立，但在实际工作中，即使质量较好的分光光度计所得的入射光，仍然具有一定波长范围的波带宽度。在这种情况下，吸光度与浓度并不完全成直线关系，因而导致了对朗伯一比尔定律的偏离。所得入射光的波长范围越窄，即“单色光”越纯，则偏离越小。,1.单色光
10、不纯所引起的偏离,2.由于溶液本身的原因所引起的偏离,朗伯比尔定律是建立在均匀、非散射的溶液这个基础上的。如果介质不均匀，呈胶体、乳浊、悬浮状态，则入射光除了被吸收外，还会有反射、散射的损失，因而实际测得的吸光度增大，导致对朗伯比尔定律的偏离。,3. 溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化其中有色化合物的离解是偏离朗伯比尔定律的主要化学因素。例如，显色剂KSCN与Fe3+形成红色配合物Fe(SCN)3，存在下列平衡： Fe(SCN)3 Fe3+ + 3SCN溶液稀释时，上述平衡向右，离解度增大。所以当溶液体积增大一倍时，Fe(SCN)3的浓度不止降低一半，故吸光度降低一半以上，导致偏离朗伯比尔定
11、律。,92 目视比色法及光度计的基本部件,一 目视比色法 用眼睛比较溶液颜色的深浅以测定物质含量的方法称为目视比色法。 光度分析法1 光电比色计光电比色法滤光片分光光度计分光光度法棱镜或光栅 （单色器）,三 光度法与目视法比较的优点：,1 准确度高。消除了人眼睛的主观误差。2 选择性强。可利用单色器消除干扰。3 使用标准曲线可简化手续加快分析速度。,分光光度计,分光光度计,四 光度计的基本部件,光源,单色器,样品室,检测器,显示器,一、显色反应的选择 待测物在某种试剂的作用下，转变成有色化合物的反应叫显色反应，所加入试剂称为显色剂。 常见的显色反应大多数是生成配合物的反应，少数是氧化还原反应和
12、增加吸光能力的生化反应。,显色剂,93 显色反应与条件的选择,对显色反应的要求1 灵敏度高，即要大，一般为104105。选择性好，最好仅与一种或少数几种显色。3 显色剂在测定波长处无明显吸收，两种有色物最大 吸收波长之差：“对比度”，要求 60 nm。4 化学性质稳定。,二、显色反应条件的选择,1 显色剂用量显色反应 为了保障反应完全，且对反应无不利影响，需通过实验确定合适的显色剂用量,确定方法：将待测组分的浓度c及其他条件固定， 加入不同量的显色剂，测定其吸光度绘制吸光度A浓度CR关系曲线，得到三种曲线.,2.反应体系的酸度 在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色溶液的吸光度。选择曲
13、线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。3.显色时间与温度 实验确定4.溶剂5.干扰的消除,三 显色剂,1 无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵等。2 有机显色剂：种类繁多（1）偶氮类显色剂：性质稳定、显色灵敏度高、选择性好、对比度大，应用最广泛。偶氮胂III、PAR等。（2）三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等,94 吸光度测量条件的选择,一 选择适当的入射波长 一般应该选择max为入射光波长 如果max处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。 如图选500nm波长测定，灵敏度虽有所下降，却消除了干扰，提高了测定的准确度和选择性。,二 参比溶液的选择,参比溶液: 在吸光
14、度测定时用来调节仪器的零点,消除由于比色皿、溶剂、试剂、其它组分对于入射光的反射和吸收所带来的误差。 原则： 试液的吸光度能真正反映待测物的浓度。,参比溶液的选择原则(1)如果仅待测物与显色剂的反应产物有吸收,可用纯溶剂作参比溶液.(2)如果显色剂或其它试剂略有吸收,应用空白溶液(不加试样溶液)作参比溶液(3)如试样中其他组分有吸收,但不与显色剂反应,则当显色剂无吸收时,可用试样溶液作参比溶液,当显色剂略有吸收时,可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂,以此溶液作参比溶液.,三 吸光度读数范围的选择 在光度计中,透光度T标尺刻度均匀,吸 光度A读数不均匀.AC，A读数不均匀，C的误
15、差也不均匀 不同吸光度A下,相同的吸光度读数误差对测定带来的浓度误差是不同的.,通过对误差进行推导, 以有限制表示浓度的相对误差： 其中: : 浓度的相对误差 T: 透光度的绝对误差. 这样以C/C对溶液的透光度T作图得如下曲线:,浓度的相对误差曲线,从曲线可见,透光度T=36.8%或A=0.434时,相对误差最小,数值为1.4%,而在20%65%(吸光度0.20.7)的范围内误差较小,且彼此接近.所以分光光度计测量的读数范围以吸光度介于0.20.7之间为宜.,95 吸光光度法的应用,一 高含量组分的测定示差法 选用浓度稍低于待测样品的标准溶液作参比溶液,调整T=100%,测定待测样品相对吸光
16、度Ar及相对透光度Tr 以普通光度法,纯溶剂或空白作参比,测定试样及标准溶液吸光度Ax，As；Tx， Ts,作图：Ar C，由Cx = Cs + C计算试样浓度。,Ar,C,示差法为什么能较准确地测定高浓度组分呢？,普通光度法（空白作参比）： cs : Ts = 10%， cx : Tx=5%， 示差法 （标准作参比）： cs : Ts =100%， cx : Tr=50%， 透光度读数标尺扩大了十倍。读数落入适宜读数 范围内，提高了测量的准确度。,二.多组分的同时测定 各组分的吸收曲线不重叠 各组分的吸收曲线互有重叠 寻找两处A差值较大的位置，分别测吸光度A1，A2根据吸光度的加合性求解联立
17、方程组得出各组分的含量。 A1 = x1 bcx y1bcy A2 = x2 bcx y2bcy 各可用x或y的纯溶液测得。,1 2,三 光度滴定分光光度法确定滴定终点。 波长745nm处,CuY有吸收,BiY无吸收. 用Y连续滴定Bi3+（先）,Cu2+（后）第一化学计量点前,吸光度不发生变化,第一化学计量点（铋）后,吸光度不断增加,第二化学计量点（铜）后,吸光度不再发生变化,四 酸碱离解常数的测定 分光光度法可用于测定酸(碱)的离解常数.它是研究酸碱指示剂及金属指示剂的重要方法. 对于一元弱酸HL,其电离平衡常数,首先配制一系列总浓度(c)相等,而pH不同的HL溶液,用酸度计测定各溶液的p
18、H.在酸式(HL)或碱式(L-)有最大吸收的波长处,用1cm比色皿测定各溶液的吸光度A，则 A=HLHL+L-L- (a),测定方法及计算,假设高酸度时,弱酸全部以酸式形式存在,即c=HL,测得AHL.则 AHL=HLc HL=AHL/c 同理,低酸度时AL-=L-c L-=AL-/c将HL、L-、HL、 L- 代入a式,作图或代入数据即可.,五 配合物组成及稳定常数的测定,设金属离子M与配合剂L的反应生成对光有吸收的配合物MLn 固定cM，改变cL得到不同吸光度.以A为纵坐标，cL/cM为横坐标作图.,当cL/cMn时,A几乎不改变; 两条线的交点所对应的横坐标cL/cM比值若为n,则组成1
19、:n.,稳定常数 对于ML: CM=M+ML CL=L+ML A=MLML(b=1cm) ML由cL/cM比值较高时恒定吸光度A0得到, ML=A0/cM(此时全部M已转化为ML即cM=ML ),例:用普通光度法测得4.00 x10-4mol/LKMnO4溶液的透光度为0.132，以此标准溶液作参比溶液，测得未知浓度的KMnO4溶液的透光度为0.50，计算未知溶液中的KMnO4浓度？（两种方法测定所用吸收池的厚度相同）,解:用普通光度法测定时，标准溶液的吸光度为 As=-lgT=-lg0.132=0.879用示差法测定时，未知溶液的吸光度A=-lgT=-lg0.50=0.301设未知KMnO4
20、溶液浓度为Cx，若用普通光度法测定时，吸光度为Ax标准KMnO4溶液浓度用Cs表示.由示差法原理可得A相对=Ax-As=b(Cx-Cs) (1)由公式A=bC可得Ax/As=Cx/Cs (2)式(2)可变为(Ax-As)/As=(Cx-Cs) (3),综合式(1)和式(3)可得A相对/As=(Cx-Cs)/CsCx=A相对/AsxCs+Cs (4)将有关数据代入上式得到Cx=0.301/0.879x4.00 x10-4+4.00 x10-4 =5.37x10-4mol/L,例:用一般分光光度法测量0.0010mol/L锌标准溶液和含锌的试液，分别测得A=0.700和A=1.00，两种溶液的透光
21、度相差多少？如果用0.0010mol/L锌标准溶液作为参比溶液，试液的吸光度是多少？示差分光光度法与一般分光光度法相比较，读数标尺放大了多少倍？,解:根据公式 A=-lgT当A=0.700时,T=20%当A=1.00时,T=10%故两种溶液透光度之差:T=20%-10%=10%若将标准溶液的透光度20%作为100%计,则试液的透光度T=1.0 x0.10/0.20=50%A=-lgT=-lg50/100=0.301示差法将读数标尺的放大倍数为100/20=5倍,六 双波长分光光度法,两束光交替照射：,试液本身作参比液。主要应用：(1)多组分混合物的测定(2)混浊样品的测定(3)反应动力学过程研
22、究,9-6 紫外吸收光谱法简介,一 有机化合物电子跃迁的类型 有机化合物三种价电子：、n 电子。 分子轨道理论：一个成键轨道反键轨道。外层电子均处于分子轨道的基态(成键或非键轨道)。,外层电子吸收紫外或可见辐射后，从基态向激发态(反键轨道)跃迁。四种跃迁: n n ,1.跃迁,所需能量最大。饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区(max200nm，只能被真空紫外分光光度计检测到)。 甲烷的max为125nm, 乙烷max为135nm。2. n 跃迁 所需能量较大。吸收波长为150250nm，远紫外区。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现 n *跃迁。如一氯甲烷、甲醇、三甲
23、基胺 n *跃迁的max分别为173nm、183nm和227nm。,3. 跃迁,所需能量较小，近紫外区， max 104Lmol -1 cm -1以上，强吸收。不饱和烃、共轭烯烃和芳类均可发生该类跃迁。乙烯*跃迁的max为162 nm， max为: 1104 L mol-1cm -1,共轭烯炔中的跃迁的吸收峰称 K 吸收带。苯环上的跃迁产生三个谱带：E1带（ max 180nm， max 104 ），E2带（ max 200nm， max 104）和 B带（ max 278nm， max = 10103）。用于芳香化合物的鉴别。,4. n 跃迁,需能量最低，吸收波长max 200nm。属禁阻跃
24、迁。摩尔吸收系数：10100 Lmol-1 cm-1，强度较弱。,分子中孤对电子和键同时存在时发生 n 跃迁。 丙酮n max 为 275nm, max 为 22 Lmol-1 cm -1,二影响紫外吸收光谱的因素,溶剂的影响：改变光谱形状(精细结构)和吸收波长 。极性大的溶剂会使*跃迁谱带红移；使n*跃迁谱带向蓝移。溶剂pH值的影响：具有酸或碱性基团时影响较大。空间效应的影响：存在空间阻碍，影响了较大共轭体系的生成，则吸收波长max较短， 小。,红移与蓝移,有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长max和吸收强度发生变化。,max向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为
25、蓝移 (或紫移)。吸收强度即摩尔吸收系数增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应。,三 紫外吸收光谱法的应用,1.化合物结构鉴定 与标准谱图对比。具有相同生色团的不同分子结构,有时会产生相同的紫外吸收光谱，但它们的吸收系数是有差别的。2.计算最大吸收波长max,思考题,1. 为什么物质对光会发生选择性吸收？2. 朗伯-比耳定律的物理意义是什么？什么是透射比？什么是吸光度？二者之间的关系是什么？3. 摩尔吸收系数的物理意义是什么？其大小和哪些因素有关？在分析化学中有何意义？4. 什么是吸收光谱曲线？什么是标准曲线？它们有何实际意义？利用标准曲线进行定量分析时可否使用透射比T和浓度c为坐标？,5
26、. 当研究一种新的显色剂时，必须作哪些实验条件的研究？为什么？6. 分光光度计有哪些主要部件？它们各起什么作用？7. 测定金属钴中微量锰时，在酸性液中用KIO3将锰氧化为高锰酸根离子后进行吸光度的测定。若用高锰酸钾配制标准系列，在测定标准系列及试液的吸光度时应选什么作参比溶液？,8. 吸光度的测量条件如何选择？为什么？普通光度法与示差法有何异同？9. 光度分析法误差的主要来源有哪些？如何减免这些误差？试根据误差分类分别加以讨论。10. 常见的电子跃迁有哪几种类型？11. 在有机化合物的鉴定和结构判断上，紫外-可见吸收光谱提供信息具有什么特点？,习题答案,作业268页 2、3、5、6、9、13
27、2、用双硫腙光度法测定Pb2+.Pb2+的浓度为0.08mg/50mL,用2cm比色皿在520nm下测得T=53%,求.,解:A=-lgT=abc-lg0.53=ax2cmx0.08mg/50mLa=86.25Lg-1cm-1=Ma=207.2gmol-1x86.25Lg-1cm-1=1.8x104Lmol-1cm-1,3、用磺基水杨酸法测定微量铁.标准溶液是由0.2160gNH4Fe(SO4)212H2O溶于水中稀释至500mL配制成的.根据下列数据,绘制标准曲线.标准铁溶液的体积V/mL 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0吸光度 0.0 0.165 0.320 0.480 0
28、.630 0.790某试液5.00mL,稀释至250mL.取此稀释液2.00mL,与绘制标准曲线相同条件下显色和测定吸光度.测得A=0.500.求试液铁含量(单位：mgmL-1).铁铵矾的相对分子质量为482.178.,解:作A-V标准曲线图,在图上找出A=0.500对应的加入标准溶液体积,根据标准溶液浓度.,A-V标准曲线,从曲线上查得:V=6.3mL试液中铁的含量为:,5、用普通光度法测定铜.在相同条件下测得1.00 x10-2mol/L标准铜溶液和含铜试液的吸光度分别为0.699和1.00.如光度计透光度读数的相对误差为0.5%, 测试液浓度测定的相对误差为多少?如采用示差法测定,用铜标
29、准液作参比液,测试液的吸光度为多少?浓度测定的相对误差为多少?两种测定方法中标准溶液与试液的透光度各差多少?示差法使读数标尺放大了多少倍?,解:直接光度法:试液的透光度为10%,标准溶液的透光度为20%.透光度读数的误差为0.5%;示差法透光度的读数放大5倍,即标样和试液的透光度分别为100%和50%. 直接光度法测试液浓度的相对误差为:,示差法测量用标准溶液作参比溶液时,试液的吸光度为： A=1.00-0.699=0.301示差法测定的相对误差为:,6、某含铁约0.2%的试样,用邻二氮杂菲亚铁光度法(=1.1x104)测定.试样溶解后稀释至100mL,用1.00cm比色皿,在508nm波长下
30、测定吸光度.(1)为使吸光度测量引起的浓度相对误差最小,应当称取试样多少克?(2)如果所使用的光度计透光度最适宜读数范围为0.200至0.650,测定溶液应控制的含铁的浓度范围为多少?,解、(1)A=0.434时,吸光度测量引起的浓度相对误差最小,设需称取试样的质量为xg A=bc,9、在0.1mol/LHCl溶液中的苯酚生物碱于波长356nm处的摩尔吸收系数为400;在0.2mol/LNaOH溶液中为17100.在pH=9.50的缓冲溶液中为9800.求pKa值.解:酸性溶液中为HL,碱性溶液中为L-,将相应的数据代入:,13、未知相对分子质量的胺试样,通过用苦味酸(相对分子质量229)处理后转化成胺苦味酸盐(1:1加成化合物).当波长为380nm时,大多数胺苦味酸盐在95%乙醇中的吸光系数大致相同,即=104.13.现将0.0300g胺苦味酸盐溶于95%乙醇中,准确配制1L溶液.测得该溶液在380nm,b=1cm时A=0.800.试估算未知胺的相对分子质量.,
