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1、第六节 温度变化及其控制,一、温度对生长的影响,不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0260C生长，嗜温菌适应于15430C生长，嗜热菌适应于37650C生长，嗜高温菌适应于650C以上生长,发酵工程控制,温度变化及其控制,每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征。在最适温度下，微生物生长迅速；超过最高温度微生物即受到抑制或死亡；在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。在最低和最高温度之间，微生物的生长速率随温度升高而增加，超过最适温度后，随温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。,发酵工程
2、控制,温度变化及其控制,微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。,发酵工程控制,温度变化及其控制,1、微生物对温度的要求不同与它们的膜结构物理化学性质有密切关系根据细胞膜的液体镶嵌模型，细胞在正常生理条件下，膜中的脂质成分应保持液晶状态，只有当细胞膜处于液晶状态，才能维持细胞的正常生理功能，使细胞处于最佳生长状态微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致。,二、微生物与温度相关性的原理,发酵工程控制,温度变化及其控制,什么是液晶状态？液晶状态是指某些有机物在发生固相到液相转变时的过渡状态称为液
3、晶态。由固态转变为液晶态的温度称为熔点，以T1表示；由液晶态转变为液态的温度称为清亮点，以T2表示。T1与T2之间的温度称为液晶温度范围。那么为什么不同微生物对温度的要求不同呢？根据细胞膜脂质成分分析表明，不同最适温度生长的微生物，其膜内磷脂组成有很大区别。嗜热菌只含饱和脂肪酸，而嗜冷菌含有较高的不饱和脂肪酸。,发酵工程控制,温度变化及其控制,2、蛋白质结构,人们采用二种方案来研究酶在低温条件下的结构完整性和催化功能：(1)通过自然或诱导突变，将特定残基发生改变的蛋白与其天然结构进行对比；(2)对比同属嗜热、嗜温及嗜冷菌的蛋白结构,通过对嗜冷酶的蛋白质模型和x一射线衍射分析表明，嗜冷酶分子间的
4、作用力减弱，与溶剂的作用加强，酶结构的柔韧性增加，使酶在低温下容易被底物诱导产生催化作用,发酵工程控制,温度变化及其控制,嗜冷菌具有在0合成蛋白质的能力。这是由于其核糖体、酶类以及细胞中的可溶性因子等对低温的适应，蛋白质翻译的错误率最低。许多中温菌不能在O0C合成蛋白质，一方面是由于其核糖体对低温的不适应，翻译过程中不能形成有效的起始复合物，另一方面是由于低温下细胞膜的破坏导致氨基酸等内容物的泄露。,3、蛋白质合成,发酵工程控制,温度变化及其控制,4、合成冷休克蛋白低温微生物适应低温的另一机制是合成冷休克蛋白将大肠杆菌从370C突然转移到100C条件时细胞中会诱导合成一组冷休克蛋白，它们对低温
5、的生理适应过程中发挥着重要作用，检测嗜冷酵母的冷休克反应，发现冷刺激后冷休克蛋白在很短时间内大量产生。耐冷菌由于生活在温度波动的环境中，它们必须忍受温度的快速降低，这与它们产生的冷休克蛋白是密切相关的。,发酵工程控制,温度变化及其控制,二、温度的影响与控制,（一）温度对发酵的影响,1、温度影响反应速率,发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。从阿累尼乌斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2 积分得 E=,E活化能,Kr速率常数,发酵工程控制,温度变化及其控制,K与温度有关E越大温度变化对K的影响越大,发酵工程控制,温度变化及其控制,温度对菌的生长、产物合成的影响可能是
6、不同的,青 霉 素,120C300C,发酵工程控制,温度变化及其控制,发酵工程控制,温度变化及其控制,2、温度影响发酵方向,四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于300C时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到350C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。,发酵工程控制,温度变化及其控制,（二）最适温度的选择,1、根据菌种及生长阶段选择,微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为370C，谷氨酸产
7、生菌棒状杆菌的生长温度为30320C，青霉菌生长温度为300C。,发酵工程控制,温度变化及其控制,在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段280C，合成期260C后期再升温；黑曲霉生长370C，产糖化酶32340C。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨
8、酸产生菌生长30320C，产酸34370C。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。,根据生长阶段选择,发酵工程控制,温度变化及其控制,例：林可霉素发酵的变温培养,问题的提出接种后10h左右已进入对数生长期，随后是10h左右的加速生长期，在40h左右对数生长期基本完成，在50h左右转入生产期主要问题：如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期？适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数量的有强生产能力的菌丝体存在,根据生长阶段选择温度,发酵工程控制,温度变化及其控制,变温培养的正交设计,发酵工程控制,温度变化及其控制,发酵工程控制,温度变化及其控制,发酵工程控制,结论：前60h按31控制，缩短了适
9、应期使发酵提前转入生产阶段，同时菌丝体已有相当量的积累，为大量分泌抗生素提供了物质基础60小时后将罐温降至3O使与抗生素合成有关的酶的活性增强，抗生素分泌量有所增加，同时因分泌期的延长有利于进一步积累抗生素发酵进入后期罐温再回升至31 使生产菌在生命的最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物。,温度变化及其控制,2、根据培养条件选择,温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。,发酵工程控制,温度变化及其控制,3、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；
10、菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。,发酵工程控制,温度变化及其控制,三、发酵过程引起温度变化的因素,（一）发酵热Q发酵,发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。现在来
11、分析发酵热产生和散失的各因素。,发酵工程控制,温度变化及其控制,1、生物热Q生物,在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。,发酵工程控制,温度变化及其控制,生物热与发酵类型有关,微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水好氧：产生287.2千焦耳热量， 183千焦耳转变为高能化合物 104.2千焦以热的形式释放厌氧：产生22.6千焦耳热量， 9.6
12、千焦耳转变为高能化合物 13千焦以热的形式释放二个例子中转化为高能化合物分别为63.7和42.6,发酵工程控制,温度变化及其控制,培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。生物的大小与呼吸作用强弱有关在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越
13、大。,发酵工程控制,温度变化及其控制,2、搅拌热Q搅拌,在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关,发酵工程控制,温度变化及其控制,3、蒸发热Q蒸发,通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热Q显热，显热很小，一般可以忽略不计。,4、辐射热Q辐射,发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5。Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q辐射,发酵工程控制,温度变化及其控制
14、,（二）发酵热的测定,有二种发酵热测定的方法。一种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。Q发酵GCm(T出T进)Cm水的比热G冷却水流量,另一种是根据罐温上升速率来计算。先自控，让发酵液达到某一温度，然后停止加热或冷却，使罐温自然上升或下降，根据罐温变化的速率计算出发酵热。,发酵工程控制,温度变化及其控制,根据化合物的燃烧值估算发酵过程生物热的近似值。因为热效应决定于系统的初态和终态，而与变化途径无关，反应的热效应可以用燃烧值来计算，特别是有机化合物，燃烧热可以直接测定。反应热效应等于反应物的燃烧热总和减去生成物
15、的燃烧热的总和。,H（H）反应物（H）产物如谷氨酸发酵中主要物质的燃烧热为：葡萄糖 159555.9KJ/Kg谷氨酸 15449.3KJ/Kg玉米浆 12309.2KJ/Kg菌体 20934KJ/Kg尿素 10634.5KJ/Kg,发酵工程控制,温度变化及其控制,可根据实测发酵过程中物质平衡计算生物热。例如某味精厂50M3发酵罐发酵过程测定结果的主要物质变化如表：,发酵工程控制,温度变化及其控制,发酵1218小时的生物热为：Q生物24159555.90.612309.2610634.51.22093415.415449.3191098.1KJ/M3191098.1631849.7每小时的生物热
16、为31849.7KJ/M3,发酵工程控制,温度变化及其控制,四、利用温度控制提高产量,例1 利用热冲击处理技术提高发酵甘油的产量,背景：（1）酵母在比常规发酵温度髙10200C的温度下经受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。（2）Lewis发现热冲击能提高细胞对盐渗透压的耐受力（3）Toshiro发现热冲击可使胞内3磷酸甘油脱氢酶的活力提高1525，并导致甘油产量提高,发酵工程控制,温度变化及其控制,实验：甘油发酵是在髙渗透压环境中进行的，因此可望通过热冲击来提高发酵甘油的产量正交条件A 冲击温度（0C） 40，45，50 B 开始时机（h） 8，16，30 C 冲击时间（分） 15，3
17、0，60结果发酵16小时，450C冲击30分钟最佳，发酵96小时后甘油浓度提高32.6，发酵罐实验见图（A）16h,450C,30min（B）12h,450C,30min,发酵工程控制,温度变化及其控制,A 温度；B 开始时机；C 冲击时间,发酵工程控制,温度变化及其控制,发酵工程控制,温度变化及其控制,A比B好,发酵工程控制,温度变化及其控制,例2 重组大肠杆菌人Cu/Zn-SOD的高表达Lac启动子，用乳糖作诱导剂 270C 300C 340C 370CSOD 4966 14270 6590 4638比活 810 1471 679 526蛋白 6.129 9.70 9.79 11.88OD
18、600 7.41 10.72 11.78 24.77,发酵工程控制,温度变化及其控制,原因：1、乳糖被用于合成菌体和其它蛋白，减少了合成SOD的原料，随着温度升高，蛋白和菌浓都增加。2、高温下可能SOD降解速率增加，杂蛋白增加3、低温下由于比生长速率低，质粒脱落减少4、低温下菌的衰老减缓，死亡率低,发酵工程控制,温度变化及其控制,小 结,微生物最适生长温度微生物对温度的要求不同与它们的膜结构有关微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致,微生物对温度的要求与酶分子结构的区别有关，如蛋白构象稳定性因素改变，活性位点关键区域氨基酸的取代，离子束缚作用(ion binding)减弱，蛋白核心区域疏
19、水作用下降等,发酵工程控制,温度变化及其控制,发酵过程引起温度变化的因素发酵热是引起发酵过程温度变化的原因Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q辐射,生物热的定义，产生的原因：基质代谢。它与菌种、发酵类型、生长阶段、营养条件有关,搅拌热与搅拌功率有关,发酵热测定: 冷却容量 燃烧热,发酵工程控制,温度变化及其控制,思考题7.16 根据微生物对温度的依赖可分类成哪几类微生物？7.17 微生物对温度要求不同的原理是什么？7.18 发酵过程的温度会不会变化？为什么7.19 发酵热的定义7.20 生物热的大小与哪些因素有关？7.21 温度对发酵有哪些影响？7.22 发酵过程温度的选择有什么依据？,发酵工程控制,温度变化及其控制,
