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1、6.4 菌种的衰退、复壮和保藏,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。,一、菌种的衰退与复壮（一）衰退 1. 定义,衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而是某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。,菌种的衰退是发生在微生物细胞群中的一个由量变到质变的逐步演化过程。,菌种原有的典型性状变得不典型时就称菌种退化，这种变异也称负变（minus mutation）。,影响微生物菌种稳定性的因素：,a）变异；,b）污染；,c）死亡；,例如，微生物菌落形态或个体形态的变化；生长速度缓慢，产孢子量减少；色素产生情况的变化；研究菌种遗传标记的丢
2、失，生产菌种生产性状的劣化等。,2. 衰退的原因,造成菌种退化的主要原因是基因突变。,误区,生产工艺条件控制不当,杂菌污染,造成生产性能下降,饰变,3. 衰退的防止,（1）选育生产性能稳定的菌株作为生产菌株,经诱变等处理后的菌种要连续传代、分离纯化，防止分离回复。,（2）控制传代次数,尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的几率。,（3）创造良好的培养条件,创造一个适合原种的生长条件，就可在一定程度上防止菌种衰退 ；例如，给予营养缺陷型适当的营养必需成分，可降低回复突变频率。,（4）利用不同类型的细胞进行接种传代,放线菌和霉菌一般用单核的孢子接种的，菌丝细胞常
3、含有几个细胞核，甚至是由异核体组成的，用于接种就易出现离异（dissociation）或衰退。,例如，构巢曲霉如用分生孢子接种易退化；如用子囊孢子接种则不易退化。,（5）采用有效的菌种保藏方法,菌种保藏的温度、所用的培养基等可影响自发突变。,（二）菌种的复壮（rejuvenation） 1. 定义,狭义的复壮：是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。,是一种消极的措施,广义的复壮：在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个
4、体。,是一项积极的措施,通过纯种分离把退化菌种的细胞群中仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，扩大培养，就可恢复正常。,（1）纯种分离法（pure culture isolation）,1. 复壮的方法,纯种分离的方法,“菌落纯”水平（pure culture in colony lever）,“菌株纯”水平（pure culture in strain lever）,粗放,精细,（2）通过宿主体复壮,针 对 病 原 菌,从典型的病灶部分分离到恢复原始独立的复壮菌株,衰退的病原菌,接种,相应的昆虫或动、植物宿主体内,活的“选择性培养基”,多次选择,（3）淘汰已衰退的个体,S. microflav
5、us“5406”农用抗生菌的分生孢子，采用1030的低温处理57天，退化的个体死亡，留下的1020个体是未退化的。,二、菌种的保藏,菌种（culture，stock culture）是一种极其重要和珍贵的生物资源。菌种保藏（preservation，conservation，maintenance）是一项十分重要的基础性工作。,在一定时间内使菌种不死、不变、不乱,基本要求：,用于长期保藏的原始菌种称为保藏菌种或原种（stoch culture）。,任务：广泛收集实验室和生产用菌种、菌株、病毒毒株（有时还包括动、植物的细胞株和微生物质粒等），并将它们妥善保藏，使之不死、不衰、不乱，便于研究、交换
6、和使用。,国家设立专门的菌种保藏机构,1. 菌种保藏的原理,首先，要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用它们的休眠体进行保藏。,其次，创造一个使微生物代谢不活泼、生长受抑制的环境条件。,再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过程中细胞受伤。,2. 菌种保藏的方法,一种良好的菌种保藏方法,保持原菌的优良性状长期稳定,方法的通用性,操作的简便性,设备的普及性,（1）定期移植保藏法,操作方法：将菌种接种在斜面、液体或穿刺培养基上，待生长完全后，置普通冰箱4保藏，湿度5070以下，棉塞换成不通气橡皮塞更好。,优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。缺点：时间短、传代多、易退化。,低温可减缓生长速度，单细
7、胞仍有一定的活动条件，一般46个月必须传代一次。,（2）液体石蜡法,操作方法：生长完全的斜面上覆盖无菌的液体石蜡，液面高于斜面1cm，普通冰箱保藏。,加上石蜡可防止培养基水分蒸发，也可隔氧，保藏时间12年，除石油发酵微生物外，各类微生物均可使用。,注意：石蜡的纯度,（3）砂土保藏法,操作方法：沙和土用酸浸泡去除其中的有机质，洗涤中和，干燥，分装于安瓶管内，加塞灭菌，把健壮的孢子悬液滴于砂土中搅拌均匀，真空干燥后封口，置于冰箱或干燥器中。,优点：低温、干燥、无氧、无营养，保藏效果好，时间可达几年至数十年。缺点：只适用于产孢子的微生物，不能用于保藏营养细胞。,（4）冷冻干燥保藏法,操作方法：是将液
8、体样品（含保护剂的菌悬液）在冻结状态下升华其中水分，最后达到干燥。培养物用无菌脱脂牛奶保护剂制成菌悬液，加入安瓶中，冷冻、抽真空、封口。,优点：低温、干燥、无氧、有保护剂，可保藏各大类微生物，保藏时间可达几十年，是目前使用最广、最有效的保藏方法。一般专业机构大都使用此法保藏。缺点：不能保藏真菌菌丝。,（5）液氮保藏法,操作方法：液氮温度可达196。把菌悬液密封于安瓶中，置液氮罐内保藏。,优点：保藏效果好。缺点：价格昂贵。,（6）基因工程菌保藏,携带外源基因的重组质粒通常是不稳定的，容易丢失。一般情况，细胞丢失了质粒，生长会加快。,基因工程菌的保藏是利用在抗性培养基中只有含重组质粒的细胞才能生长
9、的原理 。,例如，外源DNA插入到质粒pBR322中，重组质粒转化入E. coli中，使其含有Ampr和Tetr，因此在培养基中加入Ampicillin（氨苄青霉素）和Tetacyclin（四环素），即可选出含有质粒pBR322的细胞。,由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。,三、菌种保藏机构（一）国内,1978年
10、7月，中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM）在北京成立。,下设六个全国性菌种保藏管理中心1. 普通微生物菌种保藏管理中心中科院微生物研究所：细菌、真菌中科院武汉病毒研究所：病毒2. 农业微生物菌种保藏管理中心中国农科院3. 工业微生物菌种保藏管理中心轻工部食品发酵工业科学研究所,4. 医学微生物菌种保藏管理中心卫生部药品生物检定所：细菌中国医学科学院皮肤病研究所：真菌中国医学科学院病毒研究所：病毒5. 抗生素菌种保藏管理中心国家医药总局四川抗生素研究所：新抗生素菌种华北制药厂抗生素研究所：生产用抗生素菌种6. 兽医微生物菌种保藏管理中心农业部兽医药品监察所,（二）国外,1. 国际性机构,世界菌种保藏联合会（WFCC）,2. 美国,美国典型菌种收藏馆（ATCC）农业研究服务处菌种收藏馆（ARS）,3. 荷兰,真菌中心保藏所（CBS）,4. 英国,国立典型菌种收藏馆（NCTC）英联邦真菌研究所（CMI）国立工业细菌收藏所（NCIB）,5. 日本,日本微生物菌种保藏联合会（JFCC）东京大学应用微生物研究所（TAM）大阪发酵研究所（IFO）,6. 西德,发酵工业研究所微生物收藏馆（MIC）,
