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1、生物学特点,体外培养物的细胞生物学特点,总的：与体内仍有相似- 体外培养的细胞仍存在细胞和细胞、 细胞和基质的相互关系但有不同 相对孤立、相对单一 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显,体外培养物的细胞生物学特点,与体内仍有相似-体外培养的细胞 仍存在细胞和细胞、细胞和基质 的相互关系 体外培养 单个细胞也能生存和增殖 但单个细胞不是细胞永久存在的形式, 培养的细胞之间仍有在形态和机能上的 相互依存关系,1.培养的细胞之间 仍有在形态和机能上的相互依存关系。 在结构上，如： 上皮细胞仍见有桥粒 在生理活动上， 单个细胞虽能生长繁殖, 但不如群体细胞能力强， 当相邻细胞接触，便导致运动停止
2、 细胞相互沟通生物信息的结果 2.培养的细胞和基质之间 对细胞外基质仍有依存性,但有不同 人工所模拟的条件与体内实际情况 仍不完全 相同 当细胞被置于体外培养后 久了,必然发生变化与体内主要不同 相对孤立、相对单一 缺乏体内的一些影响,主要表现 失去原有组织结构和细胞形态 如：肌肉细胞纤维化 分化减弱或不显 出现类似“返祖”现象：细胞趋向单一化 或获得不死性 或变成具有恶性性状的细胞群 因此要正确认识体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体,培养细胞的主要的生物学特点,1.去分化2. 贴壁和铺展3. 接触抑制和密度依赖性,去分化,体外培养物的细胞生物学特点,体外培养生长生物学特征具有两重性
3、 基本生物学特征 仍与体内的细胞相似 培养物在体外条件下生长， 许多生长生物学行为发生改变,培养细胞分化状态的变化,体内细胞-三方面的影响与调节: 体外环境的影响 体内神经体液因素 的调节 细胞与局部微环境的相互作用 控制- 维持着细胞的分化特征。体外培养时， 失去了- 分化特征逐渐减弱,去分化(脱分化):各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能“个性”，表现出某种趋同性 如: 培养的成纤维细胞 在适当刺激下，可分化为 其它结缔组织细胞和肌组织细胞， 表现出类似未分化的间充质细胞的特性，返祖 有2点,1.但,去分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态如:高度分化的神经细胞和心肌细胞 已经丧失
4、的增生活性不可能恢复 但已经具备的生物电活动特性 不会完全失去,2. 可重新表现出分化特点 如：把表皮细胞放在气液界面上培养，可分化成 含大量角蛋白丝的角质细胞 内皮细胞-但，这种能力会随着培养时间延长 逐渐丧失总之，休外培养,使细胞 结构与功能上的“可塑性”增大 防止去分化,贴附和铺展,贴附(粘附)和附着,粘附于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本要求细胞被接种到培养器皿内以后首先要发生粘附(adherence)， 是细胞培养以后能否成功的第一步.细胞悬液后 耽搁得越久，越容易发生退化提供什么样的生长表面 是细胞能否成功粘附的主要因素。,不同细胞的粘附能力不同 如巨噬细胞、成纤维细胞等粘附
5、能力强 能在数分钟至数十分钟内粘附到固相表面 如神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱 需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面 粘附能力强的细胞- 粘附能力弱的细胞- 可利用此特点（粘附：快、牢；慢、弱） 分离、纯化细胞,细胞形态因是否贴附于底物而不同悬浮的细胞: 基本圆形粘附和贴壁的细胞: 扁平圆形 相差显微镜 “亮圈” 很快过渡-,贴附过程 ：3步贴附因子粘附细胞开始附着细胞进一步牢固附着伸展,影响因素 各种细胞不同 如接种30后第二瓶30 (附着最强)巨噬细胞一成纤维细胞 上皮细胞血细胞(最弱) 生物因素 血清、培养液中的促附着因子 机械，物理等其他因素因素 离心：促进附着 流动：培养液流
6、动可阻止细胞附着 低温：可抑制附着,措施（因素）1.包被对分化程度高、生长能力差的细胞 可在培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和 生长的生物活性物质 如:- 通过其所带电荷先吸附-, 培养的细胞再与其结合。 血清内含有多种能够 促进细胞粘附的成分 细胞本身也可能产生一些粘附分子,措施2.减少接种时细胞悬液的量待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液3.减少培养液中血清的含量 使培养液黏度降低4.培养液中离子成分及其浓度 如，培养液中的Ca含量过低时不利于 细胞的粘附、贴壁和铺展5.培养液的温度 低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁,促进细胞粘附的成分,铺展,铺展（伸展） (spread) 进行生命
7、活动的一种基本的生长特点或生长行为 铺展状况制约细胞的分裂增殖活动过程，细胞先由圆形变为 圆饼形(放射状铺展细胞) 逐渐铺开伸展成为扁平的极性细胞 极性细胞就是各种有机体细胞 在体外的特征性 细胞形态,铺展状况 是调节细胞形状的主要方面 铺展得越好，细胞越扁 意味着细胞与生长基质表面接触面越大铺展状况 与细胞的生长有密切关系 只有当细胞铺展到合适的程度 DNA合成才开始进行 通过比较贴壁依赖性细胞 不同铺展程度与DNA合成率之间的关系 发现细胞越扁(厚度越小) DNA合成率越高,细胞形状(伸展) 与细胞的生长 合适的细胞形状-伸展 对正常细胞的DNA合成重要 对其生长重要,伸展的意义,实验一
8、成纤维细胞1. 附着于玻璃或塑料底物: 细胞增殖2. 悬浮培养: 细胞不增殖3. a. 培养在悬浮的玻璃纤维上: 若够长: 细胞可增殖 若短于20um, 细胞可附着, 但增殖很慢 或不增殖 b. 在某些塑料上: 有些细胞可附着, 但增殖很慢或不增殖,伸展的意义,原因分析在1. 附着培养物上: 细胞很扁平, 很伸展在2. 悬浮培养中: 细胞圆球形, 未伸展在3. 培养中: 细胞维持介于扁平与圆球之间因此, 细胞形状, 至关重要伸展至原来的形态, 才能增殖,伸展的意义-实验,伸展的意义-实验二,PolyHEMA 35-0.0035 um 高浓度（厚） 低浓度（薄）细胞 圆 扁 （附着最差）获得细胞
9、构型（模型） 不同伸展程度的细胞PolyHEMA 细胞厚 厚（2122 um）（伸展差）（10+-2）薄 薄（2 um） （伸展好）（46+-13）,PolyHEMA Cell Height (um) H3 (C.P.M). 1.00 22 7+-5 4 x 10-2 15 50+-5 4 x 10-3 6 250+-15,细胞悬浮在培养液中时，近似球体形状 当接触坚硬平面 即铺展于底物上，扁平状 与底物形成很多接触点,伸展过程,(1)开始阶段 开始附着铺开 细胞附着于底物 球形的细胞，下方表面与底物接触成扁 但尚未形成新的伪足,伸展分几个阶段,(2) 放射状铺展阶段在球形细胞体的周围形成很多
10、伪足隆起伪足形状 主要 柱形丝状: 直径0.2-0.5um 长10-20 扁平片状: 厚0.1-0.5 宽2-5 尚有: 小泡状叶状: 直径1-2 开始时: 絲状多 以后 片状增加,许多伪足 形成薄的胞质小片牢固贴于底物 胞体中央部分 扁 整亇细胞扁平(3) 极化阶段,细胞最后伸展附着的情况 实验：用多种细胞， 以显微操作及缩时电影 定位细胞附着于玻璃和聚苯乙烯情况 检测-显微针头 结果：附着规律,附着点： 附着规律几乎未见于细胞的中央区 (如不在核之下) 总在边缘，边缘”摆动”活动的部位 凸的边缘 在薄的边缘 附着区： 约为细胞下面表面的15-35,附着、伸展的条件底物 细胞能在很多固体表面
11、附着 最终铺展的程度，取决于底物的性质影响因素： 活性物质(贴附、伸展因子):血清、培养液中， 或细胞分泌的生物活性物质被底物吸附后可利于细胞的铺展 细胞借助这些分子,可附着于各种”非特异性”的底物上 如Fn，胶原，聚赖氨酸 机械，物理因素,接触抑制和密度依赖性,接触抑制和密度依赖性生长仰制,运动的接触抑制,密度依赖性生长仰制,增殖的密度抑制实验方法：3T3细胞，接种105于6cm培养皿， 5d细胞计数 于加入10、20、30牛血清的 培养液中，结果：,增殖的密度抑制结果：10血清： 20hr后铺满 (汇合confluent) 以后至5d 细胞数不再增加 (细胞 数约1066cm皿) 密度抑制
12、 30%血清： 以后经常换液至5d， 细胞密度继续增加 (可达6xl066cm皿) 说明: 密度抑制-铺满后 不再增殖(分裂停止) 血清可降低密度抑制,只加入于3T3停止生 长的培养液中 细胞不生长 当再加入血清 细胞又生长说明血清可消除密度抑制,(2)转化细胞的密度抑制降低 用此培养液 3T3细胞不再分裂增殖 当再加入10血清， 3T3细胞可再增殖 表示血清可消除密度抑制 但当用此培养液， 于转化的3T3细胞 (SV3T3) 却生长良好 表示转化细胞密度抑制降低 (血清需要降低) 说明：转化细胞的密度抑制降低. 可生长至较高的密度,总的说明： 细胞生长有密度抑制血清可降低密度抑制转化细胞可降低密度抑制,
