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1、实验二蛋白质免疫印迹技术,一、免疫学,研究抗原物质的结构和功能；免疫应答产物的结构和功能；抗原刺激机体产生免疫应答的规律。,免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在一起，并且发展成了很多学科，如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。随着免疫生物学的发展，人们发现在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织结构（即免疫系统）。,淋巴组织,免疫活性细胞,免疫活性介质,免疫系统功能的生理和病理表现,功能名称 生理功能 病理表现,免疫防御 清除病原微生物及其它抗原性异物 超敏反应（强） 免疫缺陷病（弱）免疫自稳 清除损伤或衰老细胞 自身免疫性疾病免疫监视 清除突变或畸变细胞 防止肿瘤发生 肿瘤
2、或病毒持续性 杀伤病毒感染细胞 感染,当外源异体物质，如细菌、病毒、蛋白质、多糖等进入动物机体后，可以激活机体免疫系统，产生对外源物质的排除作用，从而保护机体免受外源物质的侵害。机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋巴细胞。,免疫应答的类型（一）固有性免疫应答（innate immune response) 又称先天性免疫应答，非特异性免疫应答：是机体在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。（二）适应性免疫应答（adaptive immune response） 又称获得性免疫应答，特异性免疫应答，是机体出生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。（具有特异性、多样性、记忆性、耐受性
3、、自限性）,抗原和免疫原性,抗原（antigens，Ag）是指能够刺激机体免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特异性反应的物质。常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋白质、核酸、激素等有机物。抗原具有两方面的特性：免疫原性（immunogenicity）和免疫反应性（immunoreactivity）。免疫原性（immunogenicity）是指抗原刺激机体引起免疫应答的能力。免疫反应性（immunoreactivity）是指抗原与相应免疫应答产物(即抗体)在体内或体外发生特异性结合反应的能力。,抗原的分类,抗原可以分为完全抗原和半抗原。完全抗原：具有免疫原性和免疫反
4、应性的抗原称为完全抗原（complete antigen） 半抗原：只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原称为半抗原（hapten），也称为不完全抗原(incomplete antigen)。与蛋白质结合后成为完全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂都属于半抗原。,抗体的种类,抗体（antibodies，Ab)是专门对抗抗原特异结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白（immunoglobulins, Ig)。存在于血清、体液中，是构成机体免疫作用的主要物质。免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同，分为五种类型： IgG、 IgA、 IgM、 IgD和IgE
5、。人体血清中IgG含量最多， IgA次之， IgM较少， IgD和IgE微量。,抗原抗体反应（antigen-antibody reaction）是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（in vivo），也可发生于体外（in vitro）。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体外反应：可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应（serologic reaction）。,二、印迹法（blotting）,印迹法是指将样品转移到固相载体上，而
6、后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern 印迹法。人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法,三、蛋白免疫印迹的应用,免疫印迹法 (immunoblotting test,IBT)，亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blo
7、t,EITB是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点。是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。,蛋白质免疫印迹检测技术,一、实验目的二、实验原理三、实验仪器四、操作步骤五、实验结果与分析六、思考题,一、实验目的,学习掌握动物抗血清的制备原理及技术通过实际操作学会动物抗血清的制备掌握Westernblotting的基本原理 熟悉Westernblotting的实验操作,二、实验原理,第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备第二部分 Westernblotting 检测抗血清,将适当的抗原物质注入动物体内，经过一定时间，动物血清中可
8、出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为免疫血清。优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物应答的能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素。,第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备,（一）多克隆抗体的概念,抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monoclone antibody）。由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。,抗体的结构,（二）用于免疫的动物,由于动物的遗传性
9、不同，同一抗原对不同动物或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。因此，进行动物免疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康动物。常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般为6个月大小的动物。,动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量。如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备。一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。,（三）抗原,抗原是多种多样的，就其化学成分
10、而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构等。,（四）免疫途径,免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等。一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1mL左右。实验中0.2mL，34点注射。,皮下注射,（五）佐剂,应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性，从而提高抗体的效价。,佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化
11、铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。,福氏佐剂（Freundadjuvant）, 通常是由羊毛脂1份、石腊油5份。这是不完全福氏佐剂。在每毫升不完全佐剂加入120mg卡介苗就成为完全佐剂。,（六）免疫方法,抗原剂量，首次剂量为1050g，加强免疫的剂量约为首次剂量的1/4。首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫时用不完全佐剂。每23周加强免疫一次。在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取23mL血，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。,抗体的产生顺序与丰度,（七）抗血清的采
12、集与保存,取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉放血，也可心脏采血。 小鼠取血。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.050.2mL），贮于-80以下冰箱，或冻干后贮存于4冰箱保存。,（八）抗血清质量的评价,在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。,效价抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法
13、常用的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。,单向扩射免疫法：以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。通常以结合率为50%的血清稀度和为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000,则该血清的效价就是1：15000 制备含有一定浓度抗血清的琼脂凝胶板（抗体固定不变）。打孔，加入不同稀释度的抗原量，进行免疫扩散。抗原与相应抗体在浓度合适时，则形成清晰的沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正比。将已知参考抗原形成的沉淀环绘成曲线，然后以待测标本的沉淀环直径查标准曲线，计算出待测抗原的含量。,双
14、向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。,双向免疫扩散,免疫扩散试验 1抗原；27为不同稀释倍数的抗体,分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图,样 品 制 备,电 泳,杂 交,转 膜,结果显示,探 针 制 备,第二部分 Westernblotting 检测抗血清,Western Blot原理,将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上；然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应；洗涤去除没有结合的特异性抗体后；加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体；加入适合标
15、记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现。,免疫印迹的实验包括五个步骤： 固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。 封闭：保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。,一抗杂交：初级抗体（第一抗体）是特异性的。二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。底物显色：被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。,三、实验仪器,动物的常规免疫 Westernblotting 检测抗血清,动物的常规免疫,注射器蜗旋混合器,四、操作步骤,动物的常规免疫 Western
16、blotting 检测抗血清,抗原的提取与制备 1）0.5mg/mL菠萝蛋白酶以0.9%生理盐水溶解配置（加少量NaOH促溶）（周二上、周五上）。 2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。 3）1mg/mL酪蛋白以0.9%生理盐水溶解配置（加少量NaOH促溶） （周四下午）。,动物的常规免疫,苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠,初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/只小鼠 （1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态 （2）用酒精棉球消毒待注射部位 （3）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL 初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两周后进
17、行加强免疫,加强免疫：初级免疫后两周进行。取1.5mL蛋白与1.5mL不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水的形态。加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/只小鼠 （1）用酒精棉球消毒待注射部位 （2）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL。第二次加强免疫：加强免疫一周后进行。操作相同。第二次加强免疫后一周，即可采血，收集抗血清。小鼠取血。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，析出血清，离心，3000rpm,10min。吸出血清，分装（0.050.2mL），贮于-20以下冰箱保存。,Western Blot一般流程,蛋白样品的制备SDSPAGE,转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色,转
18、移电泳设备,Westernblotting 检测抗血清,转膜,半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。,封闭,脱脂奶粉（5）BSAWestern Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）,一抗、二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一小时，4 过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37一小时，4 过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法,辣根过氧化物酶EC 1.11.1.7。一种糖蛋白，由于在辣根中该酶的含量很高，故名。它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。,HRP常用的生色底物有：DAB二氨基联苯胺TMB四甲基联苯胺OPD邻苯二胺一般免疫印迹中，显色反应采用生成不溶性产物的底物DAB。,五、实验结果与分析,酶标法显色,化学发光法显色,六、思考题,1. 影响制备特异性强、效价高的抗血清的因素有哪些？ 2. 如何保存抗血清？ 3. 如何检测抗血清？原理是什么？,
