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1、LC-MS/MS原理介绍,沈凯,概要,质谱法概述质谱仪的基本构成串连质谱基本原理液质联用技术基本原理,一、概述,质谱分析法(mass spectrometry)是将化合物形成离子和碎片离子，按其质荷比的不同进行分离测定，来进行成分和结构分析的一种分析方法。样品经导入系统进入离子源， 被电离成离子和碎片离子， 由质量分析器分离并按质荷比大小依次抵达检测器，信号经过放大、记录得到质谱（mass spectrum，MS）。,二、质谱分类,质 谱,同位素质谱,生物质谱,结构鉴定、定量分析、气相离子化学,化学、化工,环境、地球,药学、毒物学、刑侦,生命、医学、农业科学,有机质谱,无机质谱,七年代初用于小
2、分子分析鉴定的电离技术，如：电子轰击(Electron impact, EI)电离和化学电离(Chemical ionization, CI)技术等。 质量分析器主要为磁场分析器(magnetic Sector)。七十年代末、八十年代初出现了场解吸(Field desorption, FD)、场电离(Field ionization, FI)和快原子轰击(Fast-atom bombardment, FAB)技术。质量分析器主要为磁场分析器(sector)、四极杆滤波器(quadrupole,Q)和离子回旋共振(ion cyclotron resonance, ICR )分析器。 近十几年出现
3、了电喷雾电离(Electrospray ionization, ESI)技术、基质辅助激光解吸电离(Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)技术和表面增强激光解吸电离(Surface-enhanced laser desorption/ionization, SELDI)技术等.质量分析器为磁场分析器(sector)、 四极杆滤波器(quadrupole,Q)、离子阱分析器(Ion trap)、离子回旋共振(ion cyclotron resonance, ICR )分析器和飞行时间分析器(Time-of-flight, ToF)。
4、,三、质谱技术的发展,四、质谱技术的主要特点,（高）灵敏度是质谱的“生命”离子化（技术）是质谱的“心脏” 如， 2002年度化学诺贝尔奖授予给了J.B. Fenn和田中耕 一等三人；由于他们二人“发明了可分析生物大分子的质 谱分析法”，即电喷雾电离质谱(ESI-MS)和基质辅助激 光解吸电离质谱(MALDI-MS)。基本功能：（1）（最基本）提供分子量信息；（2）根据MS/MS或MSn等，（定性）结构分析；（3）根据LC-MS/MS方法，进行定量分析。,进入80年代以后，有机质谱的发展主要表现为两个方面： 离子化技术（包括接口技术）的创新和不断 改进 联用技术（MS/MS，LC-MS/MS等）
5、的开发 和不断完善,五、仪器概述,1.基本结构质谱仪由以下几部分组成 数据及供电系统 进样系统 离子源 质量分析器 检测接收器 真空系统,(1)进样系统:,把分析样品导入离子源的装置,包括:直接进样,GC,LC及接口,加热进样,参考物进样等。进样系统目的是高效重复地将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低。,(2)离子源:,使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置,并对离子进行加速使其进入分析器，根据离子化方式的不同,有机常用的有如下几种,其中EI,ESI最常用。,EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离硬电离。 CI(Chemical Ion
6、ization):化学电离核心是质子转移。 FD(Field Desorption):场解吸目前基本被FAB取代。FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击或者铯离子 (LSIMS,液体二次离子质谱 ) 。 ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离属最软的电离方式。 APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大气压化学电离同上，更适宜做小分子。APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):大气压光喷雾电离同上，更适宜做非极性分子。 MALDI
7、(Matrix Assisted Laser Desorption):基体辅助激光解吸基质辅助激光解吸电离。,(3)质量分析器:,质谱仪的质量分析器位于离子源和检测器之间，是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。质量分析器的主要类型有：磁分析器、飞行时间分析器、四极滤质器、 离子捕获分析器和离子回旋共振分析器等。,(4)检测接收器:,接收离子束流的装置： 二次电子倍增器 光电倍增管 微通道板,(5)数据及供电系统:,将接收来的电信号放大、处理并给出分析结果及控制质谱仪各部分工作。从几伏低压到几千伏高压。,(6)真
8、空系统:,由机械真空泵(前极低真空泵),扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组,抽取离子源和分析器部分的真空。只有在足够高的真空下,离子才能从离子源到达接收器,真空度不够则灵敏度低。,六、串联质谱的原理,串联质谱是将两个以上的质谱串联在一起形成的多级质谱。串连方式：空间上的串联：将同类型种或不同类型的质量分析器依次联结在一起。 a) 同种类型串联：四极杆串联质谱、飞行时间串联质谱等。 b) 混合型串联质谱： 四极杆和飞行时间质谱串联、离子阱和飞行时间质谱串联四极杆和离子阱质谱串联。时间上的串联：在同一质量分析器上，在不同时间里，依次实现离子的选取、离子的碰撞诱导解离(或碰撞活化解离)、离子的分
9、析，时间上的串联。 eg. 离子阱质谱仪、离子回旋共振质谱仪。,七、液质联用技术接口的发展,移动带(moving belt, MB)接口粒子束(particle beam, PB)接口热喷雾(thermospray, TS)接口连续流动快原子轰击（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB） 大气压电离(Atmosphere Pressure Ionization, API)接口（接口与电离相结合）电喷雾电离 (electrospray ionization，ESI)大气压化学电离 (atmospheric pressure chemical i
10、onization，APCI)大气压光电离 (atmospheric pressure photo ionization ，APPI),液相色谱一质谱各种联用技术的比较,八、电离方式和离子源,种类很多，介绍常用的几种：电喷雾电离 (electrospray ionization，ESI)大气压化学电离 (atmospheric pressure chemical ionization，APCI)大气压光电离 (atmospheric pressure photo ionization ，APPI),1.电喷雾离子化(Electrospray ionization, ESI),Rayleigh
11、Limit = 10 cm2/V,电场下的喷雾 带电雾滴 辅助气的作用下 溶剂的蒸发 电荷的库仑作用 带电雾滴的解体 Rayleigh 极限 表面张力和库仑斥力的平衡点,电喷雾电离的基本过程,优点： a). 离子性, 极性化合物; b).能够产生M+H+或M-H-离子的最软的离子化技术； c).低化学噪音; d).会产生多电荷离子，增加质谱的分子量范围； 缺点: a). 不能分析非极性化合物; b).在高盐条件下会发生离子抑制； c). 相对较低的LC流速 质量范围: 分子量可达1000,000 Da,电喷雾电离产生多电荷离子：,可以用质谱仪的小的质量范围测定大的生物分子，相当于将质谱仪的质量
12、范围放大的n倍。,2. 大气压化学电离(Atmosphere Pressure Chemical Ionization, APCI),样品从毛细管送入加热管中，该管可以达到300C以上。 在加热管中溶剂挥发。 加热管出口处放置电晕(Corona )放电装置, 使挥发出来的溶剂分子 电离，形成等离子体。 等离子体与样品分子反应，生成MH+或MH准分子离子。,优点： a). 可分析弱极性化合物; b). 灵敏度高 c). LC流速可达2.0ml/min 缺点: a). 易发生热裂解 b). 低质量时化学噪声大 c). 不适合做分子量大于 1000的化合物 d). 大多数的接口需要挥发性缓冲液质量范
13、围: 分子量小于2,000 Da,ESI 和 APCI比较,3、大气压光致电离 (APPI),APPI原理：APPI中利用UV来产生能量，这与APCI使用电晕放电针不同。使用时，将添加剂（甲苯）与样品同时输入离子源，UV能量首先电离甲苯分子，甲苯产生大量的光离子，在溶剂中导致一系列离子分子反应，最终使得目标化合物形成准分子离子M+H（质子转移）或M（电荷交换），或者M-H（质子吸引）。,APPI特点：气相电离用光子促进电离比APCI更加适合非极性化合物。例如: PAHs（多环芳烃）、 steroids（类固醇）等缺点：所用添加剂具有一定毒性。,九、选择离子化方法,根据样品性质确定离子化方式：高
14、极性化合物,大分子,蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；胺类、季铵盐等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯等,适合ESI(IS)。弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等，适合APCI。ESI不能分析极端非极性化合物如苯等；APCI不能分析非挥发性样品和热稳定性差的样品。碱性化合物宜用正离子方式，酸性化合物宜用负离子方式，如未知,可能正负都要做,有些化合物正负都出峰,选择灵敏度高的方式,不明确的优先用正离子方式试。,选择离子化方法,是,化合物有极性吗?,化合物热稳定吗?,化合物是酸、碱或是中性?,APCI or APPI,否,否,ESI,中性,碱性,酸性,ESI (正谱),ESI (负谱),APCI,是,谢谢,Summary,In this report I have introduced the basic theory and instrumentation of mass spectrometry. I mainly reported the ionization technique for mass spectrometry, such as ESI, APCI and APPI.,
