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1、质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用,306医院检验科 易勇2016.03,岛津（梅里埃）MALDI TOF产品系列,Linear only MALDI-TOF,Linear and reflectron MALDI-TOF PSD capability,Linear and reflectron MALDI-TOF/TOF PSD & CID capability,Unique instrument MALDI-ion trap-TOF reflectron only MSn capability High resolution and high mass accuracy,布鲁克 各类现
2、代生物质谱：,离子阱,MALDI TOF/TOF,ESI-Q-TOF,FTMS,质谱仪的工作原理,质谱仪是利用电磁学原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经加速进入磁场中，其动能与加速电压及电荷z有关，即 m/z = 2U/v2 其中z为离子的电荷，U为加速电压，m为离子的质量，v为离子初加速后的运动速度。具有速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比（m/z）的不同实现分离。,电离源,质谱仪中产生离子的装置称为离子源(ion source)。电离源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很
3、大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法。 质谱技术中的几种离子源,基质辅助激光解吸离子化 (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization，MALDI)2. 电喷雾离子化(Electrospray ionization，ESI),Sample target,Ion optics,Linear detector,Laser,MALDI-TOF MALDI: 线性工作原理,Mix matrix & sample on targetFire laser at matri
4、x/sampleIonize sample (solid to gas phase)Accelerate / extract ionsSeparate ions in analyzerRecord spectrum at detector,Time of flight (TOF) mass analyzer (field free),0,20,40,60,80,100,10000,20000,30000,40000,m/z,+ve modeM+H+ ions,MALDI基质辅助激光解析附原理: Streptococcus pneumoniae:,mass signals matching to
5、 ribosomal proteins (considering possible methionine cleavage and/or methylation) are marked in red50% of peaks unambiguously represent ribosomal proteins,protein masses obtained from the Swiss-Prot/TrEMBL sequence database,质谱仪的基本结构,一、真空系统质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态(离子源真空度应达1.310-4 - 310-5 pa，质量分析器中应达1.3
6、10-6 pa)。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、副反应过多，从而使图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。图5.1 质谱仪的构成,微生物鉴定方法,耗时,气质法（GC-MS）脂肪酸，小分子糖,MALDI-TOF MS,25/11/2022,10,微生物鉴定新方法（MALDI TOF）,比现有方法鉴定更多生物多样性的病原体分析时间仅1-2 minutes,现代微生物分类学:蛋白组学 & 基因组学,Protein,DNA,Genome,Proteome,DNA Fingerprint,MassFinge
7、rprint,SpeciesDefinition & Determination,MALDI-TOF MS,12,12,不同细菌代表性指纹图谱不同,各菌种代表性峰型分布存在显著差异，有助于鉴定各个菌种！,13,13,肠杆菌 （Enterobacteriaceae）MS图谱示:科, 属, 种特异性峰值,部分峰值是多数菌种共有的（如 m/z 4365:核糖体蛋白 L36),峰值有 科, 属, 种或 亚种-特异性,种间特异性代表峰值用来区分不同菌种,核糖体蛋白不受生长条件影响,Mass spectra of Proteus mirabilis DSM 4479 at different incuba
8、tion timesNo major qualitative changes in peak patterns distinguishing family, genus and speciesDecrease of signal intensity over timePresence and absence of peaksIdentification with 99% confidence,SARAMIS 工作流程,微生物鉴定流程,生长在固体培养基上的菌落,全细胞 MALDI-TOF谱图,数据库中参考谱图,输出可信鉴定结果,找到匹配度最可信的谱图,17,鉴定结果界面,只需数秒，全自动添加新采
9、集数据至鉴定结果界面！,不同颜色代表不同置信水平 深绿: 99.9% 浅绿: 90-99.9% 黄色: 85-90% 白色: 70-85%低于70%不显示置信值红色: 提醒复杂的结果,匹配2种或以上菌种，置信度99% :鉴定混合菌,SARAMIS鉴定混合菌种,A mass spectrum of a mixed sample containingPseudomonas aeruginosa and Achromobacter xylosoxidansShows peaks specific to both species,单核增生性李斯特菌Listeria monocytogenes (Lm)
10、 兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，自然界分布广泛，是食源性李斯特病（人畜共患病）的致病原因，低温仍具有增殖能力对老年人，婴儿，孕妇和免疫缺陷者的致死率是 20-30%该菌经常存在于速食食品中 Ex. About 2,500cases/year in USA,食品安全 Tokyo Marine University, Prof Kimura and Dr. Takahashi,Eatable without heated and cocked or cocked food, ex., ham, daily product, salad, smoked food etc,现有检测方法需要2步骤和选择培养
11、基，耗时6天,Yakult (养乐多),乳酸菌生产质量控制品种改良Performance + SARAMIS,Classified as genus = species = strain“Thickness” of database is important.,From 2011 European society of clinical microbiology and infections disease,菌种鉴定准确度,25/11/2022,22,SARAMIS：Spectral ARchive And Microbial Identification System,数据库含有超级谱图（
12、SuperSpectra ）和参考谱图（ Reference Spectra ）使用者可以创建和储存超级谱图或参考谱图软件包可实现谱图的存储，分析和比较使用者可以做聚类分析，创建系统树图用于菌株分型,SARAMIS 菌种特异峰型,合成谱图包含所有在个体谱图中出现频率大于阀值的所有峰 (如：在各谱图中出现 70% 的)在超级谱图中，所有峰值根据他们对所代表的菌种特异性而赋予权重值具有科、属特异性的峰值权重低，这些峰值不支持菌种鉴定具有菌种特异性的峰值权重则会加重,SARAMIS 比较工具,Cluster analysis of selected reference and sample mass
13、 spectra,Comparison to mass spectral patterns of reference spectra in the database,在SARAMIS数据库中一个菌种的典型代表包含典型和非典型菌株（基于质谱图谱，基因组学，表型数据）,atypical reference isolates are over-represented in SARAMIS,phylogenetic distance,phylogenetic distance,frequency,frequency,自然界菌种多样性,SARAMIS与LIMS系统,Culture from the st
14、ock in gricelol,Culture in various conditions,Collect isolates from our lab and other facilities (10),Measure MS spectra and construct Database,Apply to uncertainty, which reduce stability of identification,Difference in colony in a same media 2HW product tolerance 3 systemOperator 12peopleCulture m
15、edia maximum 5 kinds Culture length 24, 48, 72h Culture vender 3 venders,Max 3,240 spectra,深度透视数据库,MicroID system intrucduction,Version 1.0,自动鉴定界面,比对鉴定界面,MicroID,MALDI-TOF MS 微生物鉴定优势,一种对所有微生物都适用的方法无需预选测试与现代分类学结果一致高度配合有特殊需求使用者可扩展新菌种及其应用非常耐用且重复性高样品准备过程非常简化可进行高通量分析绝佳成本与效益比,32,AXIMA MALDI: 线性 & 反射不只是微生物
16、鉴定,MALDI TOF全面解决方案,布鲁克 各类现代生物质谱：,离子阱,MALDI TOF/TOF,ESI-Q-TOF,FTMS,高分辨质谱仪 全方位应用,天然产物分析药物研究蛋白质组学代谢组学.,micrOTOFQ,micrOTOFQ,Dry Gas Heater,Orthogonal Accelerator,Glass Capillary,Collision Gas Supply,Hexapole,电喷雾离子源,去溶剂系统,飞行管,检测器,反射镜,离子聚焦系统,离子漏斗式传输,四级杆Q,碰撞池,布鲁克公司独家专利设计：离子漏斗式传输系统,离子流方向,离子传输率大大提高，从而提高灵敏度。增
17、宽传输离子质量范围,离子流方向,传统的锥式离子传输,micrOTOFQ适用范围：,电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪,精确质量 (3ppm),micrOTOFQ：独特的三维信息,MS/MS提供结构信息,电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪,SigmaFit参数（同位素峰形匹配）,精确质量 (3ppm),micrOTOFQ：独特的三维信息,MS/MS提供结构信息,电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪,SigmaFit参数（同位素峰形匹配）,SigmaFit参数 同位素峰形的匹配,2,1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,C254H383N65O75S6 ,5735.65,0,2000,4000,6000,
18、Intens.,1146.0,1146.5,1147.0,1147.5,1148.0,1148.5,1149.0,1149.5,1150.0,m/z,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,模拟同位素分布峰形,实测同位素分布峰形,SigmaFit参数 同位素峰形的匹配,SigmaFit 参数 =0,SigmaFit 参数 0,436.0398,Experimental,436.0400,C12H22NO10S3,436.0367,C15H18NO10S2,0,2,4,6,0,2,4,6,435,436,437,438,439,440,441,442,m/z,sigma = 0.0167
19、,sigma = 0.0231,Intensity x 104,A,B,C,鉴定化合物的有效工具- SigmaFit,两种可能元素组成的确定,分子量 500Da未知物的元素组成预测？,人参提取液（稀释倍数 1:100; HPLC-microTOF Q）,当设置误差范围 5 ppm时：,171个可能的分子式,Generate Molecular Formula,16个可能的分子式,当设置误差范围 3ppm 时：,Generate Molecular Formula,C55H93O25,用SigmaTM参数比较同位素峰形匹配，选择Sigma值最小的分子式，即该化合物的分子式为：,Generate
20、Molecular Formula,SigmaTM参数用于比较同位素峰形匹配,1153.60114,1154.60456,1155.60742,1156.61021,C55H93O25 ,1153.60,1153.59527,1154.59868,1155.60170,1156.60459,C62H89O20 ,1153.59,0,500,1000,1500,2000,2500,Intens.,0,500,1000,1500,2000,2500,1153,1154,1155,1156,1157,1158,1159,m/z,C55H93O25,C62H89O20,SigmaTM = 0.0171
21、,SigmaTM = 0.0540,未知多肽测序测定 GluFib: MS/MS of m/z = 785.8 (+2), 动态范围的实际意义,高质量准确度测定与液质联用,常规高分辨质谱仪在液质联用时面临的挑战,LC/MS高质量准确度测定在法医药物监测中的应用Dept. of Forensic MedicineUniversity of Helsinki, Finland,Rapid Commun. Mass Spectrum 2006; 20: 1161-1167,尿样 法医毒理分析,总离子流色谱图 TIC,准确质量动态范围forensic screening: positive hits,error: 2.98 ppmsigma: 0.0165,error: 0.19 ppmsigma: 0.0084,Signal intensity: 8 x103,Signal intensity: 2 x106,布鲁克集团公司,Affiliated Companies,丰收：土地、种子、气候.质谱仪细菌鉴定：细菌纯培养、完善的数据库.（耐药性检测、混合菌检测）科研： 科研设计、大量典型的样品.种类型号众多的质谱仪，每种有其特定的用途。,
