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1、转录后加工,转录后加工,基因转录的直接产物被称为初级转录物。初级转录物一般是无功能的，它们在细胞内必须经历一些结构和化学的变化即所谓的转录后加工以后才会有功能。转录后加工可能是RNA的功能所必需的，也可能提供基因表达调控的一种手段。RNA所能经历的后加工方式可达10种以上，但后加工反应的本质要么是增减一些核苷酸序列，要么是修饰某些特定的核苷酸。,原核细胞mRNA前体的后加工,在细菌，mRNA很少有后加工。但某些噬菌体mRNA会发生最简单的剪切反应，将一个多顺反子切割成单顺反子，也有某些噬菌体的mRNA需要经过相对复杂的剪接反应才能成熟（如T4噬菌体编码的胸苷酸合酶）。,真核细胞mRNA前体的后
2、加工,加工形式 1) 5-端 = 加帽 2) 3-端 = 加尾 3) 内部 = 剪接 4) 内部=甲基化 5) 编码区=编辑后加工机制,加帽和甲基化,帽子结构和类型 0、I和 II型加帽反应：共转录 1) 酶 磷酸水解酶；mRNA鸟苷酸转移酶；鸟嘌呤-7-甲基转移酶 2) 步骤为什么只有mRNA才会加帽？功能,加帽反应,开始于mRNA 5-三磷酸的 磷酸根的水解,a,b,g,留下的5-二磷酸进攻GTP，与GMP形成共价交联，同时释放出PPi.,mRNA鸟苷酸转移酶,鸟嘌呤随后在N7位置被甲基化，甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸,0型帽子,为什么要有帽子？,提高mRNA的稳定性参与识别起始密码子的过程
3、，提高mRNA的可翻译性有助于mRNA通过核孔从细胞核运输到细胞质提高剪接反应的效率。,为什么只有mRNA加帽?,之所以只有mRNA和某些snRNA才有帽子结构，是因为它们都由聚合酶II催化，当TFIIH磷酸化CTD重复序列中的Ser5以后，它即可以将转录因子DSIF 招募到转录复合物，而新加入到复合物之中，DSIF随后将另外一种转录因子NELF招募进来，以阻滞转录。上述暂停允许加帽酶进入，来修饰转录物的5-端。第三种转录因子P-TEFb是一种激酶，在帽子结构形成不久也被招募到复合物，然后磷酸化CTD的Ser2和NELF，NELF随之失活，聚合酶II继续延伸。,3-加尾,加尾反应由两步组成：1
4、) 剪切在3-UTR一个特定序列上游10-30 核苷酸序列的位置切开2) 添加腺苷酸（100-200个）产生多聚腺苷酸尾巴,5-UTR,3-UTR,ATG,终止密码子,1) CPSF = “剪切/多聚腺苷酸化特异性因子（3个亚基）识别mRNA前体 3-UTR上的 AAUAAA 一致序列，并与此结合。2) 招募CFI和CFII = “剪切因子”3) 招募PAP = “poly(A)聚合酶”,mRNA前体在AAUAAA序列下游10-30个核苷酸的位置被CFI/II切开 产生的3-OH被PAP作为添加腺苷酸的位点。PAP不需要模板，只对ATP有亲和性 Poly(A)尾巴被 poly(A)-结合蛋白结
5、合（PABP）,加尾信号,为什么必须有尾巴？,保护mRNA免受3-外切核酸酶的消化，提高mRNA的稳定性。PABP能够与帽子相互作用增强mRNA的可翻译性，提高其翻译的效率；影响最后一个内含子的剪接；某些本来缺乏终止密码子的mRNA通过加尾反应创造终止密码子。在UG后加尾可产生UGA，在UA后加尾产生UAA；通过选择性加尾调节基因的表达。,为什么只有mRNA才会加尾？,与加帽反应一样，只有mRNA才会加尾，也是因为聚合酶II最大亚基上的CTD重复序列被TFIIH磷酸化，但是磷酸化位点为Ser2。Ser2的磷酸化将加尾因子招募到mRNA 前体上进行加尾反应。,mRNA前体的剪接,剪接这种后加工方
6、式是在发现基因断裂的现象后确定的。1977年，由Phillip Sharp和Richard Roberts领导两个实验小组几乎同时在腺病毒的晚期表达基因中发现蛋白质基因断裂现象。进一步研究表明，基因断裂是真核细胞及其病毒的基因组中的普遍现象，在高等生物的基因组中，只有很少的蛋白质基因是连续的（如组蛋白和干扰素），但在低等的真核生物，断裂基因却不多见。不同断裂基因含有的内含子数目不一定相同，同样内含子大小也会有差别。一般说来，一个典型的真核生物蛋白质的基因由10% 的外显子序列和90%的内含子序列组成。,变性,与成熟的mRNA杂交；在电镜下观察,R-环技术:真核基因内含子数目与结构分析,DNA
7、模板链,成熟的mRNA,R环实验的结果及其对结果的解释,鸡卵清蛋白基因结构及其Pre-mRNA的后加工,mRNA前体的剪接机制,mRNA前体的剪接是高度精确的。其精确性一方面取决于位于外显子和内含子交界处的剪接信号（可以将其视为内因），另外一方面取决于5种被称为snRNP的核糖核酸蛋白质复合物（可以将其视为外因）。剪接反应的“内因”剪接信号剪接反应的“外因”snRNP和剪接因子剪接反应两次转酯反应剪接体的组装,剪接信号,1. 5-剪接点,2. 3-剪接点,剪接通过2次转酯反应,+ R - OH,在转酯反应中，1个磷酸二酯键被转移到另外1个羟基上。,没有水解，无能量的损失,剪接的两次转酯反应,参
8、与剪接反应的5种snRNA,snRNP的重要性,小分子核核糖核酸蛋白颗粒（发音为 snurps） 参与剪接 一种 snRNP 由一个小分子细胞核RNA（snRNA） (100-200核苷酸长）和10种不同的蛋白质组成snRNPs和mRNA前体形成剪接体 剪接体大小与核糖体差不多，其组装需要ATP,SnRNAs,一般由60nt300nt组成，且富含U 对于剪接十分重要 调节序列的特异性和剪接反应的精确性 折叠成特定的二级结构，这对催化十分重要snRNP中起催化作用的是RNA，不是蛋白质参与剪接的只有U1、U2、U4、U5和U6,剪接体,5 snRNPs (“snurps”),小 (100-200
9、个核苷酸)富含 UU1, U2, U4, U5, U6 snRNAs,剪接体的组装与剪接反应,分支点结合蛋白（BBP）识别分支点并与它结合，剪接因子U2AF与富含嘧啶的序列结合；U2-snRNP取代BBP，并与分支点的一致序列配对。然而，U2-snRNA与分支点一致序列之间的配对并不完美，在分支点内唯独有一个A无互补配对的U，因此，这个“孤零零”的A就突出在双螺旋外而被激活，为剪接的第一次转酯反应提供了便利；U1-snRNP 与5-剪接点的一致序列互补配对；U4/U6 -U5-snRNP三聚体进入剪接体。,剪接体的组装与剪接反应（续）,U6一方面代替U1-snRNP与5-剪接点的一致序列结合，
10、另一方面与U4脱离，转而与U2结合；U6的“脚踩两只船”将分支点上突出的腺苷酸上的2-OH拉近到5-剪接点，为第一次转酯反应创造了条件；在进行第一次转酯反应以后，紧接着U5-snRNP经历了依赖于ATP的重排，将相邻的外显子并置在一起，为第二次转酯反应创造了条件；第一次转酯反应中游离出来的外显子上的3-OH 亲核进攻5-剪接点上的磷酸二酯键，导致内含子以套索结构释放出来并很快被水解，而外显子则被连接起来；一旦剪接反应完成，剪接体的所有成分即解体，U6-snRNP 与U4-snRNP重新结合参与下一轮剪接反应。,剪接体的组装和去组装,在招募U4/U6-U5 snRNP时发生的RNA相互作用,在U
11、1 和 U4离开剪接体以后发生的RNA相互作用,分支点腺苷酸2 羟基的突出以及5 剪接点和3 剪接点的结构,真核细胞剪接体的装配示意图,次要剪接途径,GU-AG规则适合绝大多数断裂基因，以此为剪接信号的剪接途径被称为主要剪接途径。但近几年来，已发现某些断裂基因的某些内含子的剪接信号并不遵守GU-AG规则，例如，人PCNA基因的第6个内含子、人软骨基质蛋白的第7个内含子、Rep-3的第6个内含子和果蝇的一种同源异形盒转录因子的内含子均以AT开头，AC结尾。除此以外，这一类内含子在5-剪接点和分支点上具有高度保守的序列，分别是ATATCCTY和TCCTTRAY。含有与这两段保守序列互补序列的U11
12、和U12-snRNAs参与AT-AC内含子的剪接，另外两种snRNAs即U4atac和U6atac分别代替U4和U6参与这种剪接途径，只有U5被证明同时参与主要剪接途径和次要剪接途径。,为什么只有mRNA被snRNPs剪接？,RNA聚合酶的CTD是剪接必需的剪接体内的剪接因子与CTD作用这保证来自RNA聚合酶II的转录物处于和剪接机构正确的相互作用的位置。,选择性剪接和反式剪接,选择性剪接 剪接是精确的，但是. 一种mRNA前体可以通过去除不同的内含子/外显子组合而剪接成两种以上的mRNA，从而导致一个基因可以编码多种蛋白质选择性剪接受到调节 果蝇的性别决定与选择性剪接有关 反式剪接发生在两个
13、mRNA分子之间的剪接比较罕见自然界只发现在锥体虫和秀丽线虫,加帽,加尾,反式剪接,mRNA前体的编辑,定义 任何发生在转录后编码区内的序列变化主要类型 1) 尿苷酸的插入 2) CU (哺乳动物的Apo B-48) 3) AI (哺乳动物谷氨酸受体的一个亚基)机制 1) gRNA 2) 特殊的脱氨酶意义 1) 提高遗传信息的容量 2) 创造终止密码子和起始密码子,COX II DNA：GTATAAAA GTAGA G A ACCT GGCOX II RNA：GUAUAAAAGUAGAUUGUAUACCTGG,尿苷酸的插入,锥体虫COXIII mRNA前体在编辑过程中插入大量的尿苷酸,杂交,编
14、辑,杂交,编辑,mRNA,gRNA,mRNA,gRNA,利什曼原虫细胞色素b mRNA通过编辑创造终止密码子,小肠上皮细胞内发生的Apo B蛋白的Pre-mRNA的编辑,发生在哺乳动物的谷氨酸受体某一个亚基mRNA上的编辑,谷氨酸受体属于离子通道。已发现体内某些谷氨酸离子通道允许Na+和Ca 2+通过，而某些通道只让Na+通过。研究表明，构成通道的某一个亚基的mRNA前体发生了编辑：在ADARs催化下，其mRNA前体某一特定的A被转变成I，致使编码Gln的密码子CAG 变成了编码Arg的密码子CIG。由于这个被编辑的密码子编码的氨基酸残基正好位于离子通道的壁上，就直接影响到了通道的通透性，当带
15、正电荷的Arg取代了原来不带电荷的Gln以后，Ca 2+无法通过。,编辑的意义,rRNA前体的后加工,原核生物 -剪切、修剪和修饰真核生物 1)剪切、修剪和修饰 （需要snoRNA） 2)剪接 （某些真核生物，如四膜虫）,原核细胞rRNA前体的后加工,真核细胞核rRNA前体的后加工,由snoRNA 指导的rRNA前体的修饰,snoRNA指导的2-O甲基化核糖和假尿苷形成,rRNA前体的自我剪接,1981年，Thomas Cech发现它是一个不依赖于蛋白质的自我催化的过程。整个剪接过程分为两步：首先是充当辅助因子的鸟苷或鸟苷酸上的3-OH亲核进攻5-剪接点上的磷酸二酯键，致使外显子和内含子之间的
16、磷酸二酯键发生断裂。同时，鸟苷或鸟苷酸与内含子的5-端形成新的磷酸二酯键；随后，刚刚暴露出来的外显子的3-OH进攻3-剪接点上的磷酸二酯键，导致这里的磷酸二酯键的断裂，这时内含子随之被切除，而两个外显子则通过新的磷酸二酯键连接起来。由于这里所发生的剪接反应没有任何蛋白质的参与，也不需要提供能量，完全是rRNA的前体自我催化，因此Cech把这种具有催化性质的RNA称为核酶，以区别于传统的蛋白质催化剂。四膜虫rRNA前体中的内含子一般被称为第一类内含子，以便将它与其它性质的内含子区分开来。 Cech随后所做的一系列定点突变实验证明了起催化作用的部分是由414nt组成的内含子（IVS-19），它还有
17、其他酶的活性。,四膜虫rRNA前体自我剪接的发现,蛋白质不是剪接必需的成分!,需要鸟苷酸 (GMP, GDP, GTP)或鸟苷,内含子,外显子1,外显子2,四膜虫rRNA前体的自我剪接,四膜虫rRNA内含子的二级结构和三级结构,IVS-19所催化的水解反应和连接反应,tRNA前体的后加工,原核生物 1) 剪切和修剪 2) 修饰 3) 添加CCA (如何需要)真核生物 1) 剪切和修剪 2) 修饰 3) 添加CCA 4) 剪接(某些真核生物),大肠杆菌 tRNATyr的后加工,核糖核酸酶 P 一种真正的核酶,发现者-Sidney Altman (为1989年诺贝尔化学奖得主) 结构与功能 1)一
18、种核酸内切酶参与tRNA前体5-端的后加工 2) 大肠杆菌核糖核酸酶 P: 14-kDa的多肽链 + 一种 377核苷酸长的RNA ( M1 RNA)。 3) 在高浓度的Mg2+下，分离的M1 RNA能单独和剪切大肠杆菌的tRNA前体。核糖核酸酶P中的多肽链提高 M1 RNA的剪切速率，允许它在生理Mg2+浓度下起作用。,酵母Pre-tRNA的剪接,已发现的核酶,种类 1) 原核生物的核糖核酸酶P 2) 第一类内含子 3) 第二类内含子 4) 大肠杆菌的23S rRNA催化肽键的形成 5) 锤头结构核酶(某些植物病毒) 6) 参与剪接的snRNA特征意义生命起源（RNA世界）,锤头核酶的结构,设计锤头核酶定向切割靶RNA,三类内含子切除机制的比较,哪一种先出现，蛋白质还是DNA？,RNA，RNA，RNARNA，RNA，RNA，RNARNA，RNA，RNARNA， RNA，RNA,RNA 世界,DNA,蛋白质,
