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1、糖分析检测,1,单糖的结构基础知识,糖的表示式,2,单糖是多羟基醛或酮。从3碳糖至8碳糖天然界都有存在。每个糖都有两个以上的手性碳原子，它们的命名规则是：碳原子的排列顺序是从醛基或者酮基基团为C-1开始的。,单糖在水溶液中形成半缩醛环状结构，即成呋喃糖和吡喃糖。具有六元环结构的糖吡喃糖（pyranose）具有五元环结构的糖呋喃糖（furanose）,糖处游离状态时用Fischer式表示，苷化后成环用Haworth式表示,单糖的结构基础知识,醛糖和酮糖甘油醛和二羟基丙酮有相同的化学组成，C3H6O3，但是不同的结构，它们属于结构异构体。,3,立体异构甘油醛有一个不对成碳原子（手性碳原子），所以它
2、有两个立体异构体，即D-和L-型。并且互为镜像异构体。,单糖的结构基础知识,Fischer与Haworth的转换及其相对构型,4,单糖成环后新形成的一个不对称碳原子称为端基碳（anomeric carbon）。生成的一对差向异构体（anomer）有、二种构型。从Fischer式看（C1与C5的相对构型）：C1-OH与原C5（六碳糖）或C4（五碳糖）-OH，顺式为，反式为。从Haworth式看：C1-OH与C5（或C4）上取代基之间的关系：同侧为，异侧为。,单糖的结构基础知识,5,糖的绝对构型（D、L） 绝对构型D-和L-的判断是从醛基或者酮基开始最远的手性碳原子。,Fischer式中最后第二个
3、碳原子上-OH向右的为D型，向左的为L型。Haworth式中C5向上为D型，向下为L型。,单糖的结构基础知识,环的构象,6,呋喃糖五元环接近在同一平面上。唯醛糖的C3、酮糖的C4超出平面0.5A，几乎是固定的结构。,六元环有船式和椅式构象，在溶液或固体状态是都是椅式构象，不是C1便是1C。C表示椅式（chair form）。,以C2、C3、C5、O四个原子构成的平面为准，C4处面上，C1处面下的标为4C1，简称C1，反之1C4简称1C。Angyal用总自由能来分析构象式的稳定性，比较二种构象式的总自由能差值，能量低的是优势构象。,多糖研究的基本步骤1、多糖链的释放、提取（水提、碱解、酶解、碱解
4、结合酶解）2、多糖的分离纯化（蛋白质去除、脱色素、小分子杂质、凝胶柱色谱、离子交换柱色谱、分级沉淀）3、多糖纯度检测（ UV、凝胶过滤、电泳、HPLC)4、多糖一级结构的测定（糖基组成、连接方式、分子量、异头碳构型、分支等）,7,糖分析常用方法：, 化学法部分和完全酸水解、乙酰解、甲醇解（水解成单糖）高碘酸氧化、Smith降解(糖苷键位置，单糖组成和分子比例，聚合度、分支)甲基化分析（糖苷键位置，包括分支点、单糖组成和分子比例） 生物法酶法（糖基连接次序，-/-异头体） 色谱法 - PC, TLC（单糖组成） - HPLC和GC（单糖组成和分子比例，定量分析） 波谱法UV（纯度检查）IR（-/
5、-异头体、吡喃环/呋喃环）MS（分子量等）NMR（-/-异头体、糖基连接次序）,8,多糖分析方法,1.单糖组成分析2.糖苷键链接分析3.异构体分析4.多糖分子量的测定5.糖的连接顺序6.保健食品中多糖的定性定量测定方法,9,水解：多糖水解成单糖。 完全酸水解：多糖与强酸（浓硫酸、浓盐酸）在（80-100 ）水解 4-10h。操作：取样20mg，加0.5-1mol/L硫酸溶液ml，充氮除氧封 管，在 水解0小时，水解液用碳酸钡中和，离心过滤，滤 液备用。 或20molL三氟醋酸（TFA）， 120恒温 lh，或2moIL TFA，100恒温 6h。 部分酸水解：0.02mol/L HCl,多糖链
6、上呋喃糖苷键、位于末端的糖苷键 和支链上的糖苷键易水解特性。水解后，醇析、离心，将上清液和沉淀 分别进行分析。 乙酰解：将多糖与乙酐、冰醋酸、浓硫酸等混合反应，可得到乙酰化单 糖，用于单糖组成分析。 甲醇解：多糖与HCl-CH3OH混合反应，半缩醛甲基化，减少异构物，有 利分辨。,1、单糖组分的确定:,10,1)纸层析(Paper chromatography, PC)：滤液与标准品同时点于滤纸上，展开剂展开后，显色，根据样品和标准品的Rf值和斑点颜色进行鉴定。,11,苯胺-二苯胺显色剂：80、10min , 醛糖显蓝、蓝紫色或蓝绿色，酮糖呈棕色，检出限量为10ug。苯胺-邻苯二甲酸显色剂：1
7、05、5-10min,戊糖显鲜红色,巳醛糖及糖醛酸为棕色,在紫外光下有荧光,而一般戊糖则无荧光,可用来区别戊糖及巳糖, 氨基葡萄糖呈浅棕斑点,紫外下呈黄绿色荧光，灵敏度为1ug。,12,）薄层层析（Thin Layer Chromatography， TLC)：硅胶（常用0.1 mol/L磷酸二氢钠溶液调配）。,水解后薄层检测：先将样品酸水解后，点样展开检测。 薄层酸水解检测:将点有待测样品的高效薄层板在12 N盐酸蒸气中60 C 水解 40 min，取出薄层板待酸挥发干以后，将标准品点于同一块板上，然后置于层析缸内展开，吹干展开剂后喷糖显色剂，与标准品进行对照。,13,苦豆子胶多糖组分的薄层
8、色谱图,1、甘露糖2、半乳糖3、混合标准单糖4、苦豆子胶多糖水解物,例：,食品研究与开发2006，27（11）：161,14,）HPLC法：A:直接HPLC法：用HRC-NH2色谱柱，乙腈-水（5：25）为流动相，示差检测器。面积归一法，还可计算各组分百分含量。B:柱前衍生化HPLC法：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化HPLC测定单糖含量，PMP是最好衍生化试剂之一，衍生物不易裂解，分析时不产生异构峰，且在250 nm处有强烈的紫外吸收。（C18）,15,例：,标准单糖HPLC图谱,库拉索芦荟多糖水解衍生物的HPLC图谱,木立芦荟多糖水解衍生物的HPLC图谱,食品科学，20
9、06，27：194,16,4) 气相色谱法（Gas Chromatography, GC)或GC-MS法：先衍生化成硅烷化衍生物，GC分离后检测糖的组分及摩尔比。可与 MS联用GC-MS 。,凡是能够气化且稳定、不具腐蚀性的液体或气体，都可用气相色谱法分析。有的化合物沸点过高难以气化或热不稳定而分解，则可通过化学衍生化的方法，使其转变成易气化或热稳定的物质后再进行分析。 局限性：不适于高沸点、难挥发、热稳定性差的高分子化合物和生物大分子化合物分析。,17,例：,混合标准单糖衍生化GC图谱,白芷多糖水解衍生化产物GC图谱,18,）高碘酸氧化法：可以选择性断裂糖分子中邻二羟基和邻三羟基处,生成相应
10、的多糖醛、甲酸(或甲醛),反应定量进行，每开裂一个C-C键消耗一分子高碘酸。如,1,2-, 1,4-, 1,6-糖苷键能够反应，而 1,3- 糖苷键的则不能，且不同位置的缩合，高碘酸的消耗量和甲酸生成量不同，用氢氧化钠滴定甲酸的量, 可以判断糖苷键位置、直链多糖聚合度、支链多糖的分支数目等。1,3-不消耗高碘酸 1,2-； 1,4- 消耗1mol高碘酸1,6-消耗2mol高碘酸, 生成1mol甲酸操作:一般取25mg样品,溶于20 mmolL高碘酸钠溶液50 ml中,在-5度暗处氧化14天，取25 ml加乙二醇ml,用0.12mol/L氢氧化钠溶液滴定，以测定甲酸的生成量。,2、 糖苷键连接位
11、置的测定：,19,1-2糖苷键,1-3糖苷键,）Smith降解法：是过碘酸氧化的改良反应，即在高碘酸氧化后，NaBH4还原，再用弱酸部分水解。水解液中和后，纸色谱法分离鉴定，以确定糖苷键的连接位置，若有葡萄糖检出，肯定有,-糖苷缩合。,20,1-4糖苷键,1-6糖苷键,21,3）甲基化分析：,羟基的全甲基化：强碱条件下（使糖基的自由羟基离子化，生成稳定的碳阴离子），与碘甲烷(或硫酸二甲酯，三甲基氯硅烷)作用，甲基化化生成甲醚。 甲基化产物的水解、还原、乙酰化：酸水解（90%甲酸）得到甲基化单糖，再经NaBH4还原为对碱稳定的糖醇，然后用乙酸酐在吡啶中乙酰化，得到各种部分甲基化的糖醇乙酰衍生物。
12、 GC和GC-MS分析：与标准谱图归属比较，可确定单糖组分的种类、比例和糖苷键的位置。 异头碳糖苷键构型、糖基顺序无法确定。,22,4）酶法, 内切糖苷酶F（天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺糖苷酶） 内切糖苷酶H（-N-乙酰葡糖胺糖苷酶） 唾液酸酶 -半乳糖苷酶 -N-乙酰氨基己糖糖苷酶-甘露糖苷酶 -甘露糖苷酶,23,）红外光谱（infrared spectrograph，IR）法：红外光谱法是一种专属性很强、应用较广（固体、液体、气体样品）的鉴别方法。 在800nm-20um连续光扫描记录下来的图谱。原理：由分子的振动及转动能级跃迁而引起的。,、异头体的测定：,24,异头体类型：型糖苷键在cm-1
13、左右处有特征吸收；型糖苷键在cm-1处有特征吸收。 呋喃糖和吡喃糖：呋喃糖在92413， 8797cm-1，吡喃糖相应在91713， 77014 cm-1处。 吡喃糖种类：-D-葡萄吡喃糖特征吸收在855833 cm-1处，-D-葡萄吡喃糖905876 cm-1。 磷酸基、磺酸基等取代基团信息,IR能给的糖结构信息：,25,）核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）法：1H-NMR中: C1质子信号小于5ppm，为型，如4.53信号为型糖苷键； 型糖苷键常大于5ppm，常在5.4-5.1ppm。13C-NMR中: 型C1:103-105 ppm, 型97-10
14、1 ppm.3）酶法：酶促反应的高度专一性，利用糖苷酶，糖苷酶对多糖底物的催化反应，可确认多糖糖苷键类型。,26,多糖的分子量测定是研究多糖性质的一项重要工作。多糖的理化性质及活性与多糖的分子量及其分布有关，如右旋糖酐： 分子量为10万-20万时能使血液中红细胞聚集，而分子量为2万-4万时，不但不使红细胞聚集，反而使已聚集的红细胞解聚，所以不同分子量的右旋糖酐在临床上有完全不同的应用。又如低分子肝素（4000-6000）：抗血栓药物；而普通肝素（3000-40000）用于抗凝血。 多糖类药物的分子量及其分布的测定，在确保生产工艺的稳定性以及临床用药的安全有效性方面，显得尤为重要。,4、多糖分子
15、量的测定：,27,数均和重均分子量：（ Number average and weight average molecular weight ） 对于多糖来说，其分子链的长短可以是一个混合物，在衡量其分子量时，往往是一个平均数。数均分子量就是依据总体分子的个数，求出分子量来的，如应用化学方法和渗透压方法测定的即为数均分子量。重均分子量就是依据各个分子的重量求出的分子量，如沉降方法，扩散方法，光散射方法测得的分子量属于重均分子量。按照理论计算，如果重均分子量和数均分子量数值相等，这生物大分子样品属于均一的样品，如果重均分子量大于数均分子量，则这生物大分子样品为混合品。混合品一定是重均分子量大于数
16、均分子量，倒过来是不可能的。因此数均分子量与重均分子量之差，是衡量样品是否均一的标志。D=Mw/Mn,28, 凝胶过滤法：lgM=a+bV HPLC法： 2005年版药典收载 专用的凝胶柱（按照所测样品的分子量大小选择 特定排阻范围的凝胶柱） 示差检测器。 GPC（Gel Permeation Chromatography）专用软件。 分子量、分布等信息。 其它法：质谱法（FAB-MS,ESI-MS），凝胶电泳法、 渗透压法、蒸汽压渗透计法、黏度法、沉淀法等等。,多糖分子量测定常用的方法,29,lg Mw=a+b tRMw 为标样的已知重均分子量； t R 为标样的保留时间。,D=Mw/Mn,
17、标准葡聚糖,样品多糖,30,5、糖的连接顺序：,酶法：利用外切酶：,或 -甘露糖苷酶、 ,或-半乳糖苷酶、 ,或-乙酰氨基葡萄糖苷酶等，从糖链的非还原端依次切下相应的单糖。核磁共振（NMR）法：二维NMR,31,6、多糖类药物定性定量测定方法,鉴别:）一般鉴别：多糖水解成单糖，在浓酸中加热脱水生成糖醛或衍生物，它们在萘酚作用下生成有色物质。）溶解度的测定：根据药典，多糖类药物测定在水、有机溶剂、稀碱溶液中的溶解度。大多数葡聚糖在水中溶解度小，不溶于有机溶剂，但溶于稀碱溶液。酸性粘多糖溶于水。）比旋度：多糖均有一定的比旋度，按照药典测定。）特性黏度：按照药典黏度测定法。,包括：鉴别，检查，含量测
18、定,32,纯度检查（杂质检查）:主要为来自原始原料的核酸、蛋白质等。常用分光光度法测260nm,280nm有无吸收来判断。,33,多糖含量测定常用方法: 1） 分光光度法 苯酚一硫酸法(Duboi S方法) ：多糖在硫酸作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚反应生成有色化合物，再用分光光度法测定其多糖含量。,标准曲线法：1）波长的选择：选择待测物质的最大吸收波长，这时灵敏度最高，且可以避免其它物质的干扰。485nm.2）标准溶液的配制及标准曲线的绘制：以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，来绘制一条标准曲线。3）待测物的含量计算：直接将待测物质的吸光值代入标准曲线计算.,34,2 ） 滴
19、定法 斐林试剂法: 该方法是先准确吸取斐林试剂甲、乙液各5mL于l50mL锥形瓶中，加热至沸腾，而后用标准葡萄糖液滴定，直至溶液蓝色褪尽为止，纪录滴定体积。然后再准确吸取斐林溶液甲、乙液各5mL，于另一l50mL锥形瓶中，准确加入2mL待测液，加热至沸腾，然后用标准葡萄糖液滴定，直至溶液蓝色褪尽为止，纪录滴定体积。最后，用差值法，计算待测液含糖量。该方法优点是所需待测液少、方便、准确、并且现像明显、所需药品价格便宜、精密度高。,滴定分析法的计算 设A为待测组分，B为标准溶液，滴定反应为： aA + bB cC + dD 当A与B按化学计量关系完全反应时，则： nA:nB = a:b 求待测溶液
20、浓度CA: 若已知待测溶液的体积VA 和标准溶液的浓度CB和体积VB，则 VA.CA=a/b VB.CB CA = a/b .VB.CB / VA,35,3） 色谱法（内标法） （1）气相色谱法 困难是多糖本身没有足够的挥发性。利用水解技术，将多糖水解为单糖之后进行衍生化反应，再用GC进行分析，以木糖醇为内标物，目前采用的衍生化方法主要是甲基化法（三甲基氯硅烷）。（2）高效液相色谱法(外标法) A:直接HPLC法：用HRC-NH2色谱柱，乙腈-水（5：25）为流动相，示差检测器。B:柱前衍生化HPLC法：PMP是最好衍生化试剂之一，衍生物不易裂解，分析时不产生异构峰，且在250 nm处有强烈的
21、紫外吸收。（C18）,36,4)生物检定法：如肝素，延长新鲜兔猪血凝血时间。目前使用多糖的检测方法包括苯酚分光光度法、色谱法和滴定法等。,37,38,核磁共振在多糖结构的应用,一维 NMR 1 核磁共振氢谱（1H NMR谱） 2 碳核磁共振谱（13C NMR谱）二维 NMR 1 1H-1H COSY 2、TOCSY(全相关)谱 3、1H-13C COSY谱（HMQC） 4、远程1H-13C COSY谱（HMBC） 5、NOESY谱 6、INADEQUATE谱,39,核磁共振氢谱（1H NMR谱）,核磁共振氢谱（ 1H NMR），也称为质子磁共振谱（proton magnetic resonan
22、ce，pmr），是发展最早，研究得最多，应用最为广泛的核磁共振波谱。在较长一段时间里核磁共振氢谱几乎是核磁共振谱的代名词。原因:一：质子的天然丰度接近 100%,核磁共振测定的绝对灵敏度是所有磁核中最大的。在 PFT NMR（脉冲傅立叶变换核磁共振谱仪）出现之前，天然丰度低的同位素，如13C等的测定很困难。二：1H是有机化合物中最常见的同位素， 1H NMR 谱是有机物结构解析中最有用的核磁共振谱之一。 在多糖中的应用 可给出的信号有在4.3-5.9ppm的异头质子.可以判断异头碳的构型(5.00为-型, 5.00 为-型). 在1.1-1.3ppm处的6-位脱氧糖的甲基双峰. 在2.0-2.
23、2ppm处的乙酰氨基的甲基峰. 在3.0-4.2ppm的非常小的区域中,结果严重重叠不能给出结构信息.,40,碳核磁共振谱（13C NMR 谱）,1 BB谱(Proton broad band decoupling): 最常见的碳谱是宽带全去偶谱(BB)，又称质子噪声去耦谱，质子噪声去耦谱可以使碳谱简化，它损失了13C 和1H 之间的耦合信息，每一种化学等价的碳原子只有一条谱线。碳谱的化学位移对核所受的化学环境是很敏感的，它的范围比氢谱宽得多，一般在 0-250ppm。对于分子量在 300-500 的化合物，碳谱几乎可以分辨每一个不同化学环境的碳原子，而氢谱有时却严重重迭。2 DEPT谱(Di
24、stortionless enhencement by polarization transfer): DEPT谱即无畸变极化转移增益法。可在质子去偶,又可在质子不去偶的条件下测定, 由于BB谱无法确定谱线所属的碳原子的级数，所以可以通过改变照射1H的第三脉冲宽度()，使作45，90 ，135 变化并测定其13C NMR谱。 = 45时，CH1和CH2和CH3均为正号。 = 90时，只有CH1有正信号，而CH2和CH3信号均为0。 = 135时，只有CH1和 CH3有正信号，而CH2有负信号。,41,在多糖中的应用,确定异头碳的数目:异头碳的共振一般出现在90-112ppm. 确定构型 :一般
25、来说-型连接的C1化学位移比-型低1.5-3.0, -型的化学位移为97-101， -型103-105，来确定确定构型。 预言多糖的聚合程度: 一般还原末端的C-1出现在90-98ppm间,而取代碳水化合物的C-1(非还原单糖)出现在98-112ppm),因而可预言多糖的聚合程度. 其他化学位移的信号: 52-57ppm间的共振信号一般为氨基取代碳的信号.170-176ppm范围的低场信号反映有己糖醛酸的羧基或乙酰基的存在.在60-70ppm间醛糖只有一个共振峰,而酮糖有两个.,42,-型,-型,异头氢区,异头碳区,-型,-型,43,2 D H-H相关谱-H-H COSY,COSY 谱本身为正
26、方形，当 F1和 F2谱宽不等时则为矩形。正方形中有一条对角线（一般为左下右上）。对角线上的峰称为对角峰（ diagonal peak）。对角线外的峰称为交叉峰（ cross peaks）或相关峰（correlated peaks）。每个相关峰或交叉峰反映两个峰组间的耦合关系。COSY 主要反映3J耦合关系。解谱方法：取任一交叉峰作为出发点，通过它作垂线，会与某对角线峰及上方的氢谱中的某峰组相交，它们即是构成此交叉峰的一个峰组。再通过该交叉峰作水平线，与另一对角线峰相交，再通过该对角线峰作垂线，又会与氢谱中的另一峰组相交，此即构成该交叉峰的另一峰组。,44,2 D H-H相关谱-H-H COS
27、Y,45,全相关谱 TOCSY、 HOHAHA,TOCSY（Total Correlation Spectroscopy）与 HOHAHA（Homonuclear Hartmann Hahn spectscopy）称为总相关谱。可从某一个氢核的谱峰出发，找到与它处于同一耦合体系的所有氢核谱峰的相关峰。TOCSY 和 HOHAHA 的用途及谱图的外观是一样的，只是实验时所用的脉冲序列不同。TOCSY 和 HOHAHA 谱目前正被越来越广泛的使用。,46,47,1H- 13C COSY谱（HMQC）,HMQC 异核多重量子相干（Heteronuclear Multiple Quantum Cohe
28、rence) C-H COSY 是13C 和1H 核之间的位移相关谱。它反映了13C 和1H核之间的关系。它又分为直接相关谱和远程相关谱，直接相关谱是把直接相连的13C 和1H核关联起来，矩形的二维谱中间的峰称为交叉峰（ cross peak）或相关峰（correlated peak），反映了直接相连的13C 和1H核，在此图谱中季碳无相关峰。,48,49,远程1H-13C COSY谱（HMBC）,50,HMBC（1H 检测的异核多键相关实验，1H Detected Heteronuclear Multiple Bond Correlation或 Long Range Heteronuclea
29、r Multiple Quantum Coherecel）。远程相关谱则是将相隔两至四根化学键的13C 和1H 核关联起来，甚至能跨越季碳、杂原子等，交叉峰或相关峰比直接相关谱中多得多，因而对于帮助推测和确定化合物的结构非常有用。,NOESY谱 和ROESY谱,二维 NOE 谱简称为 NOESY，它反映了有机化合物结构中核与核之间空间距离的关系，而与二者间相距多少根化学键无关。因此对确定有机化合物结构、构型和构象以及生物大分子有着重要意义。NOESY 的谱图与H-H COSY 非常相似，它的 F2维和 F1维上的投影均是氢谱，也有对角峰和交叉峰，图谱解析的方法也和 COSY 相同，唯一不同的是
30、图中的交叉峰并非表示两个氢核之间有耦合关系，而是表示两个氢核之间的空间位置接近。由于 NOESY 实验是由 COSY 实验发展而来为的，因此在图谱中往往出现 COSY 峰，即 J偶合交叉峰，故在解析时需对照它的H-H COSY 谱将J 偶合交叉峰扣除，对多糖谱可以用此来判断多糖的构型。当遇到中等大小的分子时（分子量约为 1000-3000），由于此时 NOE 的增益约为零，无法测到NOESY 谱中的相关峰（交叉峰），此时测定旋转坐标系中的 NOESY 则是一种理想的解决方法，这种方法称为 ROESY（ Rotating frame Overhause Effect Spectroscopy），
31、由此测得的图谱称为 ROESY谱。ROESY 谱的解析方法与 NOESY 相似，同样 ROESY 谱中的交叉峰并不全都表示空间相邻的关系，有一部分则是反映了耦合关系，因此在解谱时需注意。,51,突出表现NOE效应的NOESY谱,52,e,二维NMR,53,7、INADEQUATE谱,确定13C- 13C的连接。可以根据已知确凿的信号开始，根据相互之间的偶合进行判断。,核磁共振谱图综合解析,识别氢谱与碳谱中的溶剂峰与杂质峰。初步分析谱图，找出特征峰并确定各谱线的大致归属。分析一维1H 谱，根据谱图中化学位移值、耦合常数值、峰形和峰面积找出一些特征峰，获得一些最明显的结论。对照13C 质子噪声去偶
32、谱以及各个 DEPT 碳谱，确定各碳原子的级数。按照化学位移分区的规律，大致确定各谱线所属的区域，如在饱和区还是在不饱和区，是否含杂原子、羰基以及活泼氢等。借助二维核磁共振谱对图谱作进一步的指认。解析H -H COSY 谱，从一维谱中已经确定的氢谱线出发找到与之相关的其它谱线。解析13C -1H COSY（或 HMQC、HSQC）谱，同样从已知的氢谱线出发找到各相关的碳谱线，以此推断出这些碳谱线的归属。解析13C -1H 远程相关谱（COLOC 或 HMBC），从已确定的碳谱线出发，找到与之相关的各氢谱线或从已知的氢谱线出发找到各相关的碳谱线，由此完成对一些未知谱线的指认。在二维谱中由于一些相关峰的强度较弱，在实验中常常未被检测到，另外在图谱中还常常会出现假峰，这些在二维谱的解析中应特别注意。,54,谢谢！,55,
