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1、食品微生物学检验,沙门氏菌检验 GB 4789.4-2010志贺氏菌检验 GB/T 4789.5-2003菌种传代与保藏,沙门菌的分布,沙门菌广泛存在于自然环境中。通过沙门菌病患者或健康带菌的人和动物的排泄物污染环境和食品。易于污染的高危食物：畜禽肉类、蛋、奶及其制品。沙门菌在肉类中不分解蛋白质，不产生靛基质，所以当食品污染了沙门菌后，通常没有感官性状的改变。,沙门氏菌检验程序,目的：修复损伤的细菌细胞。缓冲蛋白胨水(BPW) 肉汤：是基础增菌培养基，不含任何抑制成分，有利于受损伤的沙门菌复苏。使受损伤的沙门菌细胞恢复到稳定的生理状态。方法：25 g（mL）样品置于盛有225 mL BPW的无
2、菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀，直接进行培养。于36 1 培养8 h18h。,前增菌,轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL, 转种于10 mL TTB 内, 于42 1 培养18 24 h。同时, 另取1 mL, 转种于10 mL SC内, 于36 1 培养18 24 h。 分别用接种环取增菌液1环, 划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或显色培养基平板）。于36 1 分别培养18 24 h (XLD琼脂平板、HE琼脂平板、显色培养基平板) 或40 h48 h (BS琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落。,选
3、择性增菌与分离,划线接种，分离纯化,典型菌落-BS,菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色, 菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落, 周围培养基不变。,国产BS,进口BS,典型菌落-XLD,进口XLD,国产XLD,菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心,典型菌落-CHRO,菌落为紫红色,注意事项,亚硫酸铋琼脂（BS）：该培养基制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性，应在临用时配制，超过48h不宜使用。将已挑菌落的平板储存于2 5 或室温至少保留24 h，以备必要时复查。,志贺氏菌,需氧或兼性厌
4、氧。在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、中等大小的菌落。在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。,志贺氏菌检验程序,采样样品处理选择性增菌选择性平板分离生化试验结果报告,1.样品处理：无菌操作称取检样25 g（mL），置于盛有225 mL GN增菌液的无菌均质袋中，用拍击式均质器以8 000 r/min10 000 r/min均质拍打1 min2 min。2.增菌培养：置于36培养6-8h，培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微浑浊时即应中止培养。3.分离：分别用接种环取增菌液1环, 划线接种于一个SS琼脂平板和一个EMB平板。于36 1 分别培养18 24
5、 h (观察各个平板上生长的菌落，志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落）。,志贺氏菌检验,注意事项,1.志贺菌在常温存活期很短，因此，当样品采集后，应尽快进行检验，如果在24h内检验，样品可保存在冰箱内。 2.增加鉴别培养基的数目，可以增加志贺菌的阳性检出率，用于分离的鉴别培养基一般不少于两个。中等选择性的SS琼脂平板一个，弱选择性的EMB琼脂平板一个。,鉴定,API 20E,VITEK,菌种的传代与保藏,菌种保藏及应用 干菌种（0代） 液体培养基复苏（1代） 液体培养基复壮（2代），加等体积20%无菌甘油混匀，1ml/管 冻存管分装，-20或-80保存 。 使用时取1支冻存管自
6、然（室温）解冻，接种至5ml液体培养基按规定培养、稀释（3代）,注意：已经解冻的冻存管不能再冷冻保存，以免冻融！,我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。,干菌种(安瓿)的开启：,菌悬液的制备,每次使用取分装好的甘油冻存管移入接种室或净化工作台，放置室温后接种至已灭菌营养肉汤中( 5ml/支, 生孢梭菌用10ml硫乙醇酸盐流体培养基), 将已接种毕的细菌管置3537培养1824小时，取出备用。各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。,操作步骤,1、接种前用1：1000新洁尔灭擦拭工作台面，然后开紫外灯消毒30分钟。2、自冰箱取出保存工作
7、用菌种，室温放置20分钟，温度平衡后才能传代。3、实验人员进入缓冲间，换鞋、穿无菌衣、戴口罩，用1：1000新洁尔灭溶液消毒双手，并将培养基及菌种移入阳性菌接种室。4、接种后置规定温度、时间培养。取出观察，菌种生长良好，放入冰箱保存备用。,2-8可保存6个月；-20可保存12个月；-80可保存24个月。,保存时挑取细菌新鲜纯培养物，接入菌种保存管。拧紧保存管，来回颠倒几次使细菌乳化，不能旋摇。,用无菌移液器将菌种保存管内的液体吸取干净，妥善放置被吸出的液体。,使用时无菌条件用灭菌的针或镊子取出小瓷珠。,小瓷珠直接划线或加到合适的液体培养基中。,保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第
8、三代的培养物。 必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。浓菌液一般于冰箱中保存可用7天。菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在28的可以在24小时内使用。对于具有稳定的孢子形态的黑曲霉和枯草芽孢杆菌，可以使用孢子储备液，在验证过的期间内，其稳定的孢子储备液可以保存在28一直使用。,注意事项,注意事项,黑曲霉转种操作应在超净工作台（或相当此环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯操作；每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。保藏时，乙型溶血性链球菌用血肉汤（琼脂）培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。,菌种保管,菌种保管应有专人负责，专柜贮藏，确保菌种安全。因工作变动时，必须做好交接工作。菌种应有详细登记本，记录使用、转移及销毁情况和原因，菌种管上应有标签，表明菌种编号、代次、批号、日期。购置菌种，应有介绍信。全部保存菌种应具备清单，并定期向部门负责人报告。 过期菌种应及时处理、登记，经121 30分钟灭菌消毒。,谢谢大家!,
