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1、聚合酶链反应及基因突变检测方法,上海交通大学医学院刘湘帆 讲师,聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。,PCR反应的特点,特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 简便、快速 24 小时完成扩增对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板,一、PCR反应原理和反应过程,DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94 C 95 C 退火（an
2、nealing）:40 C 70 C 延伸（extension）:72 C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。,PCR原理,d.NTPs,耐热DNA聚合酶,引物,添加反应混合液及样本,变性,退火,加入试管中,延伸,继续延伸,循环,PCR原理,第二个循环4个拷贝,第三个循环8个拷贝,第n个循环2n个拷贝,PCR原理,The Polymerase Chain Reaction (PCR),18,20-30X,94 C(30 s),40-60 C(30 s),72 C(30-60 s/kb),Melt,Anneal,Extend,Cyc
3、le #2,NIH,20-30X,二、PCR的反应体系和反应条件,（一）PCR反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。,1 模板,包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等 模板DNA需较高的浓度 RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板 模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng,2、引 物（Primers),引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段化学合成的寡核苷酸能与模板特异地结合引物决定产物的特异性和长度引物设计时必须遵循一些原则,设计引物的原则：,二条引物分
4、别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补长度为18 25个核苷酸二条引物之间避免形成引物二聚体引物的碱基组成应平衡引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G）引物的5端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）,引物浓度：0.1 0.2umol/L,浓度过高容易生成引物二聚体,3、脱氧核苷三磷酸（dNTP）,是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧 核苷三磷酸的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异 性扩增也随之增加 dNTP浓度：20 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增,4、DNA聚合酶,从一种生活在热泉（8090
5、）中的水栖 噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取， 有很高的耐热稳定性 Taq 酶的作用: 模板指导下，以dNTP为原料，在引物3-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3, 5 -磷酸二酯键，使DNA链沿53方向延伸，催化DNA合成。 最适酶量：1-2.5U （酶量过多，导致非特异性扩增）,Taq DNA聚合酶复制的保真性：Taq DNA聚合酶无3 5外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。,耐热的 DNA多聚酶：Pwo DNA
6、polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2 10倍。,5、镁离子浓度,镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应 系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响 虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关， 但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及 鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离 Mg2+的浓度从而影响酶的活性。 当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。,6、其它反应因素,H：调节至酶反应所需的最适pH（ pH =7.2左右）盐
7、：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交基质：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性）,（二）PCR的反应条件,反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）,1、温度,变性温度：94 97 退火温度：低于引物Tm 5 左右 温度过高：降低扩增效率； 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶 促活性,2、时间,第一次变性应给予足够时间（5 7分钟） 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒 1分钟，时间过长易导致非特异性扩增,3、循环次数,
8、重复次数一般设为2535个循环扩增反应的平台效应： 理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长,指数增长期线形增长期平台期,循环数 #,PCR过程的实时监测,平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。平台效应产生的因素： 引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等,三、PCR技术的质量控制,（一）实验室的规范化设置实验室的规范化设置： 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 PCR技术的质量保证： 基因扩增检
9、验的全过程的质量保证 室内质量控制和室间质量评价 PCR实验系统中的污染源及防污染措施,防污染体系：正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施、反应体系中以dUTP取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可破坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质量,（二）PCR技术的质量保证 分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理、贮存 分析中因素：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置 对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等） 分析后因素：报告形式、反馈的信息等,第二节 以PCR为基础的相关技术,以PCR为基础的相关技术,逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-
10、PCR)定量PCR (quantitative PCR )多重PCR (multiplex PCR) 免疫PCR差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR)PCR诱导定点突变原位PCR (in situ PCR),一、逆转录PCR（RT-PCR）,以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等,逆转录生成cDNA方式：以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物， mRNA3末端polyA尾与之互补以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引
11、物，进行扩增,二、定量PCR,对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析。主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等在定量PCR反应体系中，除了常规PCR反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是-肌球蛋白基因,绝对定量 PCR外参照系统的设置内参照系统的设置,实时定量 PCR 对核酸扩增反应进行直接和动态的监测， 实现对靶基因的实时定量分析,荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测PCR的方法FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进
12、行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量,荧光信号的检测方法：1、DNA结合染料技术2、水解探针技术（TaqMan probe）技术3、杂交探针技术,TaqManTM,d.NTPs,Thermal Stable DNA Polymerase,Primers,Add Master Mix and Sample,Denaturation,Annealing,Reaction Tube,l,TaqManTM,Extension Step,1. Strand Displacement,2. Cleavage,3. PolymerizationComplete,4. Detection,l,实时定量RT
13、-PCR检测CEA基因拷贝数在监测胃肠癌微转移中的应用,CEA 基因在消化系统上皮腺癌， 尤其是直结肠癌和胃癌中高表达， 因此在肿瘤细胞内可检测到其转 录本，而在正常成人体内极少表 达。,正常成人体内CEA基因表达,胃肠癌肿瘤组织中CEA基因的表达,在肿瘤发生血道转移时，外周血 中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、 特异的技术检测到这些肿瘤细胞 中CEA基因的转录本，是发现肿 瘤早期转移的关键。,胃肠癌患者外周血中CEA基因的表达,三、多重PCR,在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。,DMD基因外显子缺失的检测,四、差异显示PCR（differential d
14、isplay PCR,DD-PCR）,一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。,差异显示RT-PCR(Differential display RT-PCR),第三节 点突变的检测技术,PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP） 等位基因特异性寡核苷酸 （allele specific oligonucleotide, ASO）单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP） 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 融点曲线分析（meltin
15、g curve analysis）PCR产物的序列分析,点突变,一、 已知点突变的检测方法 1.PCR-RFLP 利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。,Bcl I RFLP（血友病A）,2.等位基因特异性寡核苷酸杂交,被检基因经PCR扩增后转移到膜上，分别与长度为1520bp、经标记的正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。由于20个碱基中仅一个碱基差异即可使DNA分子的Tm值下降 5
16、7.5，因此通过严格控制杂交条件，可使PCR产物仅与完全互补的探针杂交，根据有无杂交信号即可判断被检者的扩增片段中是否带有突变点。,3.DNA芯片技术（DNA chip）,在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龙膜等）表面有序地阵列一系列固定于一定位置的分子（探针），当标记样品（如用化学荧光法、化学发光法标记）与探针进行杂交后，用共聚焦荧光自动扫描等技术获取信息，经计算机系统处理、分析后得到结果。,s,4. Southern印迹杂交,二、未知点突变的检测方法,1. 单链构象多态性（single-strand conformational polymorphism，SSCP） 突变DNA的PCR产
17、物经变性后产生两条与正常 DNA构象不同的单链，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳时，不同构象的片段显示不同的电泳迁移率，从 而能区别正常与突变的DNA。SSCP只适用于检测 150200bp长度的DNA片段。,2. 变性梯度凝胶电泳（DGGE）,利用不同序列的DNA分子具有不同的融点温度(Tm)的特性。设计引物时使被扩增的目的片段含有2个不同的区域，一个Tm较高，另一个较低，将该PCR产物在由变性剂形成的梯度凝胶上进行电泳，由于正常序列的PCR产物与突变的 PCR 产物的Tm不同，在电泳过程中Tm较低的区域被部分解链的先后不同，造成电泳迁移率的变化也不同，最后在凝胶中所处的电泳位置也不同，据此可以
18、区别正常片段与突变片段。,3.异源双链分析（heteroduplex analysis，HA）,正常DNA和突变DNA在一起变性后再缓慢复性，可使两者互补形成异源杂合双链，并在错配处形成一个凸起。在非变性凝胶电泳时，异源双链片段会产生与相应的同源双链片段不同的迁移率，从而使二者分开。,4. 熔点曲线分析(melting curve analysis）,DNA片段中突变碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链，所产生的Tm较完全配对的同源双链的Tm低，在仪器上显示出不同的曲线从而将突变序列检测出来。所需仪器如高效液相色谱仪(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系统、LightCycler等。,5.DNA序列分析（DNA sequencing）,Sanger测序技术： 以待测序列的单链DNA作为模板，加入一个引物和dNTP作为底物，并加入一定比例的2，3-ddNTP，在DNA聚合酶的作用过程中，正常dNTP的掺入使链延伸，若ddNTP的掺入则使链终止，这样就可以得到一系列长度不同的以四种ddNTP结尾的DNA片段，经电泳后可直接读出碱基序列。,PCR测序演示版,1,2,第四节 PCR技术在分子诊断中的应用,PCR技术在分子诊断中的应用,感染性疾病中病原微生物核酸的检测单基因遗传性疾病的基因诊断多基因病相关基因的检测肿瘤相关基因的检测移植配型和法医学上的应用,
