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1、.,1,基因工程的原理,1、概念： 基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,.,2,限制酶,结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。,以大肠杆菌中的一种叫做EcoR的限制酶为例：,2. 基因工程最基本的工具,限制性内切酶,.,3,基因的针线,作用：将互补配对的两个黏性末端缝隙连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。,DNA连接酶,.,4,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,.,5,2.常用种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。,1.作用：将外源基因导入受体细胞。,基因的运输
2、工具运载体,a对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。b具标记基因。c能自我复制。通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失。d具有一个或多个限制酶切点，供外源基因插入其中。常用载体质粒：裸露的，结构简单且独立于细菌染色体DNA之外的，具有自我复制能力的小型环状DNA分子。,.,6,最常用的运载体质粒,分布：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中。,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。,本质：细胞染色体(或拟核)外能自主复制的小型环状DNA分子。,标记基因,.,7,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,.,8,
3、一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工化学合成,基因操作的基本步骤,.,9,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,基因文库的构建方法之一,（1）直接分离法,.,10,第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶
4、的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,2022/11/27,10,基因文库的构建方法之二: cDNA合成法,.,11,.,12,mRNA 反转录cDNA(互补DNA） DNA聚合酶双链DNA,反转录法：,12,.,13,某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,反转录法：cDNA的合成流程图解,基因文库的构建方法之二,.,14,.,15,(二)利用PCR技术扩增目的基因,PCR聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。,.,16,过
5、程,高温变性（解旋为单链）,低温退火（引物与单链互补结合）,适温延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链）,重复循环,.,17,实际具体过程,.,18,PCR技术,原理：前提：原料方式,PCR扩增仪,DNA复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式扩增， 即_（n为扩增循环的次数）,指数,2n,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）,.,19,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个
6、DNA分子,.,20,DNA合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRNA核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,合成,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法通过DNA合成仪直接合成目的基因。,（三）人工合成,.,21,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,目的基因能直接进入受体细胞吗?,.,22,二、基因表达载体的构建核心,.,23,二、基因表达载体的构建核心,.,24,二、基因表达载体的构建核心,目的基因,.,25,选择限制酶的要求,不在目的基因、载体上的复制原点、启动子、终止子序列内部切割在载体上只
7、能切开一个缺口（保证表达载体的完整性）保证酶切后目的基因与载体末端相同（黏性末端互补或同为平端）与载体连接后，应使目的基因与载体上启动子的转录方向一致一般选择能在目的基因两端形成不同末端的双酶切，此法还可减少载体和目的基因的自身环化（但应注意双酶切去除片段不能包含必需元件！）,.,26,基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们各自的作用是什么?,.,27,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是
8、为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,.,28,1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,3、目前转基因工程可以A. 打破地理隔离但不能突破生殖隔离B. 打破生殖隔离但不能突破地理隔离C. 完全突破地理隔离和生殖隔离D. 部分突破地理隔离和
9、生殖隔离,C,.,29,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,三、将目的基因导入受体细胞,.,30,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,.,31,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合
10、并表达的方法。,.,32,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,.,33,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,.,34,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细
11、胞吸收DNA,.,35,将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,.,36,(四)目的基因的检测与鉴定,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等,个体水平的鉴定,.,37,返 回,.,38,思考与探究：,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出
12、不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存
13、在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,.,39,复习题,1）将目的基因导入受体细胞有哪些方法?(试举例说明),2）简述农杆菌转化法,.,40,基因工程的应用,专题基因工程,.,41,一、植物基因工程硕果累累,哪些转基因作物已进入大规模商业化应用阶段?,转基因大豆、玉米、棉花和油菜,.,42,(一)抗虫转基因植物,1.虫害给农作物带来了哪些影响? 传统农业如何防治害虫? 有哪些不足?,2.现在已有哪些抗虫植物问世?,.,43,3. 抗虫基因,Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等,请阅读P18生物资料技术卡,了解一些抗虫基因的抗虫机理。,4.
14、抗虫棉的目的基因是什么?目的基因从何而来?,.,44,1.什么是病原微生物？有哪些种类？,引起生物生病的微生物，主要有病毒、真菌和细菌等,2.在抗病转基因植物中使用最多的是什么基因？,病毒外壳蛋白（coat protein，CP）基因； 病毒的复制酶基因,（二）抗病转基因植物,.,45,在抗真菌转基因植物中使用什么基因？,几丁质酶基因和抗毒素合成基因,（二）抗病转基因植物,.,46,（三）其他抗逆转基因植物,1.哪些环境条件会造成农作物低产、减产？,盐碱、干旱、低温和涝害等,2.盐碱和干旱对农作物的危害与什么有关？,细胞内的渗透压调节,在抗盐碱和抗干旱作物中使用了什么基因？,调节细胞渗透压的基
15、因,.,47,3.转基因耐寒的烟草和番茄中哪种目的基因提高了其抗寒能力？目的基因从何而来？,鱼的抗冻蛋白基因,.,48,4.抗除草剂基因有何用途？,喷洒除草剂时，杀死田间的杂草而不损伤作物,.,49,（四）利用转基因改良植物的品质,人体（或其它脊椎动物）必不可少，而机体内又不能合成的，必须从食物中补充的氨基酸，称必需氨基酸。必需氨基酸共有种：赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸（甲硫氨酸）、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸。如果饮食中经常缺少必需氨基酸，可影响健康。 另外12种氨基酸是人体细胞能够合成的叫做非必需氨基酸。,.,50,你知道哪些食品中缺少必需氨基酸？如何用转基因的方法加以改良？,将必
16、需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物改变必需氨基酸合成途径中某种关键酶的活性,.,51,转基因延熟番茄的目的基因是什么？,控制番茄果实成熟的基因,.,52,转基因矮牵牛的目的基因是什么？,与植物花青素代谢有关的基因,转基因蓝玫瑰,.,53,总结：基因工程在农业上的应用,（1）高产、稳产和具优良品质的品种 用基因工程的方法可以改善粮食作物的 蛋白质含量。如“向日葵豆”植株。 （2）抗逆性品种 将细菌的抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高温等抗性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。如转基因抗虫棉。,.,54,二、动物基因工程前景广阔,（一）用于提高动物生长速度,动物品种改良、建
17、立生物反应器、器官移植等,导入外源生长激素基因,.,55,（二）用于改善畜产品的品质,举例说明,将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，转基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大减低。,（三）用转基因的动物生产药物,设问:就基因药物而言，最理想的表达场所是哪里？,转基因动物的乳腺。,.,56,（1）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。 （2）从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯，表达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。 （3）从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的同时，转基因动物又可繁殖。,设问:为什么乳腺能成为基因药物最理想的表达场所呢？,.,57,
18、将药物蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的受精卵中，将受精卵送入母体，使其发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁生产所需要的药品，称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。,乳腺生物反应器,乳腺生物反应器的优点：产量高；质量好；成本低；易提取。,.,58,获取目的基因（例如血清白蛋白基因）构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）显微注射导入哺乳动物受精卵中形成胚胎将胚胎送入母体动物发育成转基因动物,思考:用基因工程技术实现动物乳腺生物反应器的操作过程是怎样的？,.,59,（四）用转基因动物作器官移植的供体,利用基因
19、工程对猪的器官进行改造,方法：将器官供体基因组导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官,.,60,1.在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素等直接从生物体的哪些结构中提取？,从生物的组织、细胞或血液中提取。,2.传统生产方法的缺点:,由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。,三、基因工程药品异军突起,.,61,3.可利用什么方法来解决上述问题？,利用基因工程方法制造转基因的工程菌，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。,工程菌:用基因工程方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。,基因工程药品包括：细胞
20、因子（即淋巴因子如白细胞介素2、干扰素）、抗体、疫苗、激素等,.,62,胰岛素是治疗糖尿病的特效药。一般临床上使用的胰岛素主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取45g胰岛素。用该方法生产的胰岛素产量低，价格昂贵，远不能满足社会需要。1979年，科学家将动物体内的胰岛素基因与大肠杆菌DNA分子重组，并在大肠杆菌内实现了表达。1982年，美国一家基因公司用基因工程方法生产的胰岛素投入市场，售价降低了30%50%。,基因工程药品 胰岛素,.,63,治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生
21、长激素。 现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。,基因工程药品 生长激素,.,64,干扰素是动物或人体细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白。干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一种抗病毒的特效药。此外干扰素对治疗癌症和某些白血病也有一定疗效。传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细胞内提取，每300L血液只能提取出1mg干扰素。19801982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，是传统的生产量的12万倍。1987年上述干扰素大量投放市场。,基因工程药品 干扰
22、素,.,65,基因工程与环境保护,环境监测： 检测环境中的病毒、细菌等污染。,1t水中有10个病毒也能被检测出来,快速灵敏,.,66,利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。,.,67,环境污染治理,1）用基因工程产物“超级细菌”分解石油，可以大大提高细菌分解石油的效率。,3）通过基因重组构建新的杀虫剂，取代生产过程中耗能多、易造成环境污染的农药，并试图通过基因工程回收和利用工业废物。,2）用基因工程培养出“吞噬”汞和降解土壤中DDT的细菌，以及能够净化镉污染的植物。,.,68,1、基因治疗概念：,四、基因治疗曙光初
23、照,把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效的手段。（把特定的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，从而达到治疗疾病的目的）,2、实例：,将腺苷酸脱氨酶基因转入取自患者的淋巴细胞中，再将这种淋巴细胞转入患者体内。,(1)对严重复合型免疫缺陷症的治疗,.,69,.,70,3、基因治疗的类型,4、基因治疗的发展现状：处于初期的临床试验阶段,.,71,DNA分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。当用一段已知基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。,知识回顾：基因诊断,.,72,上图四
24、种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四环素的抗性基因。回答下列问题：（1）基因工程中使用的限制酶的特点是 DNA分子。（2）将两端用E1切开的Tcr基因与用E1切开的质粒X1混合连接，连接后获得的质粒类型有 。（可多选）AX1 BX2 CX3 DX4（3）将目的基因导入大肠杆菌，需要用 对受体细胞进行处理。（4）若将上图所示X1、X2、X3、X4四种质粒导入抗生素敏感大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上。在这两种培养上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有 、 。,.,73,（1）特异性识别并切割（2）ABC（3）Ca2+（或CaCl2） （4）无质粒的细胞（或未导入成功的细胞） 含X-3的细胞,（1）基因文库 限制性内切酶、DNA连接酶（2）基因工程（或者转基因技术） 病毒b（3）O2和CO2,.,74,思考与探究:根据所学内容，试概括写出基因工程解决了哪些生活、生产中难以解决的问题。,基因工程可以生产人类需要的药物，如胰岛素、干扰素等。我们吃的某些食品如番茄、大豆等也可以是基因工程产品。农业生产中的抗虫棉、抗病毒烟草、抗除草剂大豆等都已进入商品化生产，上述产品有些是常规方法难以生产的或者生产成本过高。,.,75,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,
