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1、2022/11/27,第三章高效液相色谱分析High Performance Liquid Chromatography, HPLC,2022/11/27,3-1 高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法： 一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 它在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、高灵敏度检测器。,2022/11/27,2022/11/27,1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高压： HPLC采用高压输液设备, 150-350*105 Pa 高速： HPLC流速大增，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：
2、化学键和固定相, 30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）,2022/11/27,2、HPLC与GC的区别分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；HPLC采用的流动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来
3、控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。,2022/11/27,3-2 高效液相色谱法理论基础,速率理论 P69,2022/11/27,速率方程： H=A+B/u+Cu（1）液体的扩散系数仅为气体的万分之一，HPLC中速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，（2）影响柱效的主要因素是传质项。,2022/11/27,2、提高柱效的途径：提高柱内填料均匀性，减小固定相粒度（选择薄壳形担体）选用低粘度的流动相或适当提高柱温，降低流动相粘度; 减小粒度是最有效的途径.,2022/11/27,3-3 高效液相色谱法主要类型及分离原理1、液液分配色谱法2、液固吸附色谱法3、
4、离子交换色谱法4、离子对色谱5、空间排阻色谱法,2022/11/27,1、液-液分配色谱,固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 分离机制：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相色谱），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相色谱）。 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用; 目前应用最广的固定相:化学键合固定相,2022/11/27,正相色谱与反相色谱比较正相色谱固定液极性 流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分反相色谱固定液极性 流动相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适
5、于分离非极性组分反相色谱：固定相： C-18柱 流动相：甲醇-水或乙腈-水,2022/11/27,2、液-固吸附色谱,基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样 缺点：非线性等温吸附常引起峰的拖尾；,2022/11/27,3、 离子对色谱（分离有机酸、有机碱）,原理：流动相中加入离子对试剂，使被测组分的溶质离子与其电荷相反的对离子形成中性离子对，以改善分离 分析酸（阴离子分离）：常采用烷基铵类，如：氢氧化四丁基铵 分析碱（阳离子分离）：常采用烷基磺酸类，如：己烷磺酸钠； 反相离子对色谱： 固定相：非极性的疏水键和相
6、 (C-18柱) 流动相：含有对离子的甲醇-水或乙腈-水,2022/11/27,4、 离子交换色谱,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 基本原理：组分在固定相上发生的离子交换反应；不同组分与离子交换剂之间亲和力的大小不同。 应用：在溶液中可电离的物质，氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。,2022/11/27,5、空间排阻色谱,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子可以进入到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100-1
7、05范围内的化合物按质量分离,2022/11/27,3-4 液相色谱固定相,1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳。 现采用10m以下的小颗粒,（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面积小，柱容量低；需要高灵敏度的检测器。,现在510 m全多孔型担体使用广泛,2022/11/27,化学键合固定相,定义：用化学反应的方法通过化学键把有机物分子结合到担体表面。（目前应用最广、性能最佳的固定相） 制备方法： a. 硅氧碳键型：
8、 SiOC b. 硅碳键型： SiC c. 硅氮键型： SiN d. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；,2022/11/27,化学键合固定相的特点,（1）表面无液坑，比一般液体固定相传质快；（2）无固定液流失，增加了色谱柱稳定性和寿命（3）可键合不同官能团，选择性好（4）有利于梯度洗脱；分离机制：分配 + 吸附,采用化学键和固定相的液相色谱称为化学键和相色谱。（化学键和相色谱类型及应用见表3-2）,2022/11/27,2.液-固吸附色谱固定相,种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 目前，510 m硅胶微粒（全多孔型）使用最
9、广,2022/11/27,3.离子交换色谱分离固定相,结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相 键合薄壳型；键合微粒担体型（键合离子交换基团） 树脂类别：（1） 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2） 阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）,2022/11/27,4. 空间排阻分离固定相,（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、
10、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。,2022/11/27,3-5 液相色谱的流动相,1. 流动相特性 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。 流动相对组分有亲和力，流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况,2022/11/27,2. 选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）溶剂粘度小些,（5）流动相同时还应满足
11、检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,2022/11/27,3. 流动相选择,在选择流动相时，溶剂的极性是选择的重要依据。 例：采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 常用溶剂的极性顺序：水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小) 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,2022/11/27,3-6 高效液相色谱仪器,2022/11/27
12、,液相色谱仪（1）,2022/11/27,液相色谱仪（2）,2022/11/27,流程及主要部件 process and main assembly of HPLC,1.流程,高压输液系统,进样系统,色谱柱,检测系统,数据记录及处理系统,2022/11/27,2.主要部件,高压输液系统（储液器、高压泵、过滤器）高压泵为了获得高柱效，HPLC使用粒度很小的固定相（10m），液体流经色谱柱受到的阻力大应具有流量稳定、压力平稳无脉动等特性。分为恒流泵、恒压泵，各有优缺点。目前恒流泵逐渐取代恒压泵。,2022/11/27,梯度洗提装置（P84）,梯度洗提：流动相中含有两种或以上不同极性的溶剂，在分离过
13、程中按一定程序连续改变流动相的组成来改善和提高分离效果。,与气相色谱中程序升温的区别：（GC）程序升温通过改变 来达到改善分离（HPLC）梯度洗提通过改变 来改善分离,柱温,流动相的组成,2022/11/27,(2) 进样系统,注射器、进样阀（六通阀）通常使用六通阀，,2022/11/27,(3) 色谱柱,柱体为直型不锈钢管，标准柱子的内径为4.6 mm 或 3.9mm，柱长1530 cm，填料一般510m。发展趋势是减小填料粒度以提高柱效和减小柱径减少溶剂用量,2022/11/27,(4) 检测系统,a. 紫外-可见检测器和光电二极管阵列检测器 紫外-可见检测器（UVD） 应用最广，适用对紫
14、外光（可见光）有吸收的物质 特点：通用性较好，对大部分有机化合物有响应； 灵敏度较高； 检测器对流动相的温度变化和流速不敏感（梯度洗提）；,2022/11/27,光电二极管阵列检测器（PAD、DAD）,紫外检测器的重要进展；采用2048个二极管或更多组成阵列，得到三维色谱-光谱图。 优点: (1)可获得组分的全部光谱信息，很快定性鉴定组分； (2)可判断组分纯度。,2022/11/27,b. 荧光检测器（FLD）,特点： 高灵敏度、 高选择性；对多环芳烃，维生素、氨基酸、蛋白质等有响应；,利用试样具有荧光特性,2022/11/27,c. 示差折光检测器（通用型检测器） （ differenti
15、al refractive index detector）,可连续检测参比池和样品池中溶液之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比。,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 缺点：对温度敏感、不能用于梯度洗脱；,2022/11/27,3-7 高效液相色谱分离类型选择 choice of separation types,根据分离分析的目的、试样的性质、现有设备条件选择合适的方法。可根据试样的相对分子量、溶解度、分子结构等进行初步选择。 1、根据相对分子量选择 相对分子量低、挥发性好气相色谱 相对分子量2002000液固、液液、离子交换色谱 相对分子量2000排阻色谱,2022/11/27,2
16、、根据溶解度选择样品溶于水不离解反相色谱样品溶于水并能离解离子交换色谱样品溶于烃类（苯或异辛烷）液固吸附色谱样品溶于甲醇反相色谱3、根据分子结构选择异构体液固吸附色谱同系物正相色谱、反相色谱,2022/11/27,2022/11/27,3-8 HPLC的应用 application of HPLC,1. 环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：示差折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,2022/11/27,2. 稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。,固定相：十八烷基
17、硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器,2022/11/27,3-9 液相制备色谱,制备色谱：利用色谱技术分离、制备大量纯组分的有效方法。,2022/11/27,1.色谱柱的柱容量（柱负荷）分析柱：不影响柱效时的最大进样量；制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。制备柱允许超载（以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜）,2022/11/27,2. 液相制备色谱的方法,收集组分时，通常有以下情况： （1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率(图3-28）； （2）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。,2022/11/27,3.液相制备色谱仪,液相制备色谱仪 ：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；检测器后增加馏分收集器。 制备柱：内径2050mm，柱长50cm。,
