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1、分光光度法,南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心,内容,3,分光光度法,概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特点。,分光光度法的原理,Lambert定律,分光光度法的原理,Beer定律,分光光度法的原理,Lambert-Beer定律,如果同时考虑液层厚度和溶液浓度对光吸收的影响，将Lambert和Beer定律合并，描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系。,分光光度法的原理,如何求被测组分的含量,1.利用标准管计算测定物的含量2.利用标准曲线计算
2、测定物含量3.利用标准系数法求出待测溶液的浓度4.利用消光系数法求出待测溶液的浓度,利用标准管计算测定物的含量,在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），同时也测定末知浓度（CU）的吸光度（AU），,利用标准曲线计算测定物含量,先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各管的浓度（C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。,标准曲线(浓度-吸光度曲线）,根据
3、测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。,C,V-1100型可见光分光光度计,0.000,MODE,PRINT,A：吸光度T：透射比C：浓 度F：斜 率,V-1100分光光度计键盘控制的使用说明,V-1100分光光度计操作步骤,开机，预热30分钟。转动波长旋钮，调所需波长。按 键切换到T档。将黑体放入光路中，合上盖，按 键校零,T=000.0。开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按 键校T=100.0合上盖，按 键切换到A档 拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中 ，即可读取其吸光度A值。重复3次，记录3组数据。读数后，将
4、黑体放入光路中，开盖取出比色杯。将参比液倒回原试管中，清洗比色杯并倒扣在滤纸上晾干关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。,MODE,MODE,V-1100分光光度计 使用注意事项,注意防震、防潮、防光和防腐蚀。每台仪器所配套的比色皿不能与其他仪器的比色皿单个调换。不可用手指或毛刷摩擦比色杯的透光面。盛装参比液时，达到比色杯的3/4即可，不宜过多，以防溶液溢出。比色杯外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸拭净。注意比色杯的清洁，用后应先用自来水冲洗，再用蒸馏水清洗。测试结束要及时登记，仪器有问题及时报告。,操作练习实验材料,试剂： CuSO4标准液 （8mg/ml） 待测CuSO4溶液 蒸馏水器材：加样枪、刻度吸管、试管、试管架 V-1100型可见光分光光度计,操作练习步骤,分别取3支试管，做好标记，按下表操作：,以空白管B调零，在690nm处，读取标准管S和待测管U吸光度A值，记录3组数据，取平均A值，代入公式计算。,数据处理表格,各管各测定3次，取其平均A值再代入公式计算。,结果计算,南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心,Thank You !,
