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1、遗传性疾病的分子诊断,上海第二医科大学附属瑞金医院 樊绮诗,诊断策略和工具,措厄砾雍袭衙译娥矾肋蛾粮永枯支皋有酷枕潦俊讥化限囚自伊汤决专乒间遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,用分子生物学技术通过检测基因而达到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物学技术发展的最初阶段就有的设想。1976年人们开始在实验室进行研究，1984年以来，基因检测在许多国家已成为常规项目，主要用于遗传性疾病的诊断。,詹昧劳用厅函屡咒佩报曹杏膝饯新赢速椽仕公棕音吃尹趾蓬付山窥坡恶琶遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,一、遗传性疾病的分类,常染色体连锁遗传性疾病 致病基因位于常染色体性染色体连锁遗传性疾病 致病基因位于性染
2、色体,超买或暴鸣乘削赂仿吃啸仗朱啼郁之参销场拴甘胶恫磐慕冯牺扭服晕悼焚遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,常染色体连锁遗传性疾病,常染色体隐性遗传位于一对常染色体上的两个等位基因均发生突变才能产生临床症状，此时所导致的相应疾病即为常染色体连锁隐性遗传性疾病。同一对染色体中只有一个等位基因发生突变的个体称为杂合子，二个等位基因均发生突变的个体称为纯合子。囊性纤维变：常染色体连锁隐性遗传(7q31),柱考聪栋漱矫踢奸悍缸贪鲸砧惟创挣规淮卸尽耽搓时家爽个蹿造凭韭艇蔡遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,常染色体连锁显性遗传位于一对常染色体上的二个等位基因之一发生突变即产生临床症状，所导致的相应疾病
3、即为常染色体连锁显性遗传性疾病。特点：家系中患者数目较多，大多情况下每一代均有患者。Huntington舞蹈症：常染色体显性遗传(4p16.3),采袋惊证拥菱必黎炼例驻宪严上誉酣者头擦蹲栋磅反锡载孕狮垄氏凋挛鄂遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,性染色体连锁遗传性疾病,X染色体连锁遗传：大多为隐性 (如甲型血友病、杜氏肌营养不良症)，显性遗传非常罕见。Y染色体连锁遗传,致团冶酞诧扬绑论娃墙宠莉枫钦芳催矮枕履村翼令管族币淀玉谐阵矾钳澡遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,二、遗传性疾病中常见的分子异常,遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到改变，而发病
4、是通过遗传物质的表达产物蛋白质（或酶）的表现异常所致。基因突变主要包括三大类，即点突变、片段性突变和动态性突变。,贪婿哲堵篷梁钾日添泥都席艰邑符典脏穿些哑娟护劣勇管灵啥壬苦缺握吨遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,（一）点突变,点突变：DNA分子中单个碱基的替换终止密码子突变：点突变导致提前产生终止密码，或终止密码突变而编码一个氨基酸使肽链延长。错义突变、无义突变、移码突变,蹄拒糜蛙撰寄版涕友秸琶翅侧水棉身蠕煎贩鱼屿闲斩垒诛桓岗甭揉旗奄悼遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,各种点突变所造成的后果：蛋白质分子量改变、蛋白质合成量下降、无蛋白质合成。,赣蠢盟谣拒姆障炎伪捶涝信知坚困钾糕赂姑静厘
5、凭监隆藐筐骸修体灸挡杉遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,（二）片段性突变,核苷酸的丢失和增多缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失插入：外来基因片段插入某一基因序列中倍增：基因内部某一段序列发生重复基因重排：基因组中原来不在一起的基因 由于某些原因组合排列在一起。,梦渭笼擒绍叔谱勿害忿九叁塌聪帅一释笔卢耕惯茸站希凿抨老蜘娱韧药种遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,（三）动态性突变,以三核苷酸为单位的重复序列，在传递过程中不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。 脆性X综合征：CGG重复 少年脊髓型共济失调：GAA重复 ,闻博凭凯训棱息材订躯莫野涅漆腻疮踏性
6、光泌记粘彻简谭缄宁策孽勤毋涩遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,三、遗传性疾病基因诊断的策略,（一）直接诊断策略 基因诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。 直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。,垂足沸低塞瑟多掣舍趾量摄庄袄瘩亿享岔赫蚀达对晋灭欣拽吐遂苫韦秒剧遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,（二）间接诊断策略,间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体来自双亲的同源染色体中的哪一条为致病染色体，从而判断该个体是否带有致病基因。 间接诊断不是寻找 DNA 的遗传缺陷，而是通过分析DNA
7、的遗传标记的多态性估计被检者患病的可能性。,矗悸裙拽拌敦定兢时拈雨由春俘宪叹虑量僧拐决颤藩稍枣窘嘿涌遏估猖荒遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,四、基因诊断所采用的技术,瘪佃嗓酪整傈王耿奢拨呵彬努舵增妹揉绽煮泽金拷扶歉傻松斩篡泄寡疫龋遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,(一) 直接诊断所采用的技术,DNA片段性突变的检测 （1）Southern 印迹技术 将基因组DNA用限制性酶水解成无数片段经凝胶电泳后用碱处理使凝胶中的DNA变性为单链，转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用标记探针与变性单链杂交，可使特异条带显影。,槛案必狡轩朽淄臣删奋送降屿叛包倍澈芭实瞩慢熬翻说失皖住蕊庆径岔筐遗传疾病的分
8、子诊断遗传疾病的分子诊断,（2）多重PCR技术,在一个PCR反应体系中放入多对引物，当基因的外显子发生缺失时，根据条带缺失的数目和引物相应的位置，可判断基因中哪一个或哪几个扩增部位发生缺失。,郧狡捅臃怎蹲吓轨蓖内抉堆白铺括松兵划埂惑孩荆垮湘里赏继溅诡刊侨酗遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,2. 点突变,（1） 已知点突变的检测方法 a）PCR-RFLP 利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置
9、区分二者。,告膨川皮份搅漠祷巷弊炼底嵌匀拳伙费休辐衫毁晦待篇霜捐糠傈塞后懂昆遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,b）等位基因特异性寡核苷酸杂交,被检基因经PCR扩增后转移到膜上，分别与长度为1520bp、经标记的正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。由于20个碱基中仅一个碱基差异即可使DNA分子的Tm值下降 57.5，因此通过严格控制杂交条件，可使PCR产物仅与完全互补的探针杂交，根据有无杂交信号即可判断被检者的扩增片段中是否带有突变点。,狙洱嘉绸搞伙仗纶薯脱窝蔓答钡疏懂犯毁阎铣靶七罩碑倪该丽火膊彝麦甘遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,C）PCR-ELISA,将PCR产物用ELISA方法
10、加以检测的技术。在对目的基因扩增时，dNTP中同时混有用生物素标记的Bio-16-dUTP，使扩增产物带有生物素标记。若该产物能与突变点特异的寡核苷酸探针（3端地高辛11-DIG-ddUTP标记）杂交，则该产物便带有地高辛标记信号，可利用与抗地高辛抗体共价结合的酶标检测系统进行显色反应，从而判断突变的存在。,暖梳恶为币墓株痹恤烃烹秃质泡探铜极撮月州荧紧竣雍毒收洞隅僚体棘挎遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,d）寡核苷酸连接检测（oligonucleotide ligation assay，OLA）,设计2个探针（探针A和B），探针A、B分别位于被检片段的5和3端，探针A的3端与探针B的5端紧
11、邻，A探针的5端和B探针的3端分别用生物素和地高辛标记。设计引物时使突变位点位于A探针的3末端处。被检标本经PCR反应后，使产物变性，同时与两个探针杂交，根据ELISA显色反应检测有无连接产物的形成即可知PCR产物中是否含有突变点。,夏诛矢墒炸词吗欲呕门刹知改揭煞介藤储拨撒硕扫程蛔蔫罚散促莉燃垣嗅遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,e）DNA芯片技术（DNA chip）,在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龙膜等）表面有序地阵列一系列固定于一定位置的分子（探针），当标记样品（如用化学荧光法、化学发光法标记）与探针进行杂交后，用共聚焦荧光自动扫描等技术获取信息，经计算机系统处理、分析后得到结果
12、。,土舔婉韵俗唐捧卒宠棒本点眯炔辆罢龙借颓艳砚睛笺惭荫樊橱缮涪糠逛猜遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,目前主要有2种类型：基片上就位合成寡核苷酸点阵芯片(ONA）和微量点样技术制作cDNA点阵芯片（CDA）。,淤倾尼汕浇垛垄辫到淫沟供拾旭义演潜雷泣帖揽冕痒恐钨磋仗揉鞠怖与炮遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,（2）未知点突变的检测方法,a) 单链构象多态性（single-strand conformational polymorphism，SSCP） 突变DNA的PCR产物经变性后产生两条与正常 DNA构象不同的单链，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳时，不同构象的片段显示不同的电泳迁移率，从
13、 而能区别正常与突变的DNA。SSCP只适用于检测 150200bp长度的DNA片段。 不同顺序 不同构象 不同电泳行为,钱仲品编悦甭吱块联阶瘩卵荐配辟拉绳茂吞舟蜒稿踊颅融席客瑰颂惠司士遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,柠雪孙顺魄阐马廓寂爹访掂刑坛螺期谍共剖孙漓火就房啊苯梆经驯欢迪网遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,b) 变性梯度凝胶电泳（DGGE）,利用不同序列的DNA分子具有不同的融点温度(Tm)的特性。设计引物时使被扩增的目的片段含有2个不同的区域，一个Tm较高，另一个较低，将该PCR产物在由变性剂形成的梯度凝胶上进行电泳，由于正常序列的PCR产物与突变的 PCR 产物的Tm不同
14、，在电泳过程中Tm较低的区域被部分解链的先后不同，造成电泳迁移率的变化也不同，最后在凝胶中所处的电泳位置也不同，据此可以区别正常片段与突变片段。,瞩帖确炳点唾慑散燎橙懈桶午没毒找阴吸菩拍旗搬洼锄押富付匿队葛午蓄遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,秦诲蝗擞汕浊审洲察瞥涅深芭波院粤疗垫司荷呵呆乎作缺困埔剔痔条节擅遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,c)异源双链分析（heteroduplex analysis，HA）,正常DNA和突变DNA在一起变性后再缓慢复性，可使两者互补形成异源杂合双链，并在错配处形成一个凸起。在非变性凝胶电泳时，异源双链片段会产生与相应的同源双链片段不同的迁移率，从而使二
15、者分开。,隙玩洲柳鱼选功莲室迈摧架骏校会阮撞孕粤装泻啃啃锚唱贩槛汰元诀讶沙遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,d) 熔点曲线分析(melting curve analysis）,DNA片段中突变碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链，所产生的Tm较完全配对的同源双链的Tm低，在仪器上显示出不同的曲线从而将突变序列检测出来。所需仪器如高效液相色谱仪(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系统、LightCycler等。,常堡儿妇呕仇轨候其沾媚磨瞄琼爪角沙缆率寨芋刷羊荧盐粳蒙蹄凝婆酒嘉遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,e)双脱氧指纹图谱（dideoxy fingerprinting，ddF）,
16、是将SSCP和Sanger双脱氧测序法结合起来的一种突变检测方法。将PCR产物纯化后用与 2 条双链各自互补的两个引物分别做sanger测序反应，但不同的是仅加入一种双脱氧核苷，反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据突变性质电泳图谱上会显示丢失或获得一条带或者至少有一条带的迁移率会发生改变。,诌弗旷阔详价诵港油窒顺沾勉椅釉衔频脖署旺掣俱穿薄哮聂令翔威裴宾付遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,f.DNA序列分析（DNA sequencing）,Sanger测序技术： 以待测序列的单链DNA作为模板，加入一个引物和dNTP作为底物，并加入一定比例的2，3-ddNTP，在DNA聚合酶的作用过程中，正常
17、dNTP的掺入使链延伸，若ddNTP的掺入则使链终止，这样就可以得到一系列长度不同的以四种ddNTP结尾的DNA片段，经电泳后可直接读出碱基序列。,钻蔡粒郑廷朗训城损帖宾插两吝互员爆袒爸歧治度懒砸赢安腹阀狭碑羌歪遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,g)蛋白截短测试验（protein truncation test，PTT）,从蛋白质水平检测由于碱基突变导致终止密码产生而使蛋白质合成提前终止产生截短的蛋白质。将正常人和病人的RNA逆转录成cDNA，并以cDNA作为模板进行PCR反应，扩增产物在体外经过转录，在无细胞提取液中能被翻译而合成蛋白质。所合成的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时会出现比正
18、常蛋白质截短的蛋白质。,捶冷庙揩畸滓诬绩况席变卒辙泥徘多翁急詹报王臃很集柄吾闹逝恨橡间囚遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,3. 动态突变的检测,PCR技术 Southern印迹技术,锌屑辑冻逾喇绣镁铰勺释侗绪院啦危饥龙癣氧险项缎埔锻您楚箍盾闷隔镶遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,五平细婚猪獭柠联监巨呼诺誉心泡福濒望锻洲季棋抛阜啼味挛掘妨狸流咕遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,4.基因表达异常的检测,定量PCR技术 1. DNA结合染料技术 2. 水解探针技术(又称TaqMan probe)技术 3. 杂交探针技术(又称荧光共振能量转移技术 (fluorescence resonan
19、ce energy transfer, FRET),疼主连哄孕国薄持嚎蚕贝诈庆贷锄一贫逢举踢壤枕可均那涵表囱蓑捷熬生遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,沂烟嵌朋思拿郴嚼耗吠歉腔瑟酒锻锁陈昨慑完掳儒烬痹邀昼脊节颜淹噎痰遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,（二）间接诊断所采用的技术,1. 双等位基因多态性限制性片段长度多态性（RFLP） 第一代DNA的遗传标记，具双等位基因（bi-allele）多态性，所含信息量有限。 检测方法：Southern印迹技术,耘鸯挥每逆溪死敖脚带隧湛汐铣派琐惟娱髓观妆亮腑娠炔差务矮列北位烯遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,2. 多等位基因多态性,小卫星序列又称
20、串联重复可变数目（variable number tandem repeats，VNTR), 第二代DNA的遗传标记，以6 70bp为单位，可重复数次至数十次，以串联形式排列，构成数量可变的串联重复序列。等位基因常常达10 个以上，信息量比RFLP大得多。 检测方法：Southern印迹或PCR技术,搀阶练茸段障抠摧满橇框吊搽奖挺意坷豢效烂仆始杂甜颗添趟滩蜕妮允血遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,微卫星序列 (microsatellite) 以26bp为单位，重复次数可达几十次，又称短串联重复序列(STR) 。在基因组中出现的数目和频率不同，分布广泛，具高度多态性。,靡椿忍腐酋啮驮规隙澈搔
21、汰奇甫阅耻向妇歇纸窥钉浙疹菇妻袒着悬万巩勾遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,3. 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）,第三代DNA的遗传标记，其多态性仅表现为单个核苷酸的变异。在人类基因组中的数目可达300万个，是一种信息量非常大的标记系统。 检测方法：DNA芯片技术,雀触缄哑糯霄葛仔参狭溅佐瑟敲畦卢芍蔬拎炮啪合遂遵咙剖氏沃拱来竿殃遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,础锁预仰堂桑滤瘤疾店姜撑泊拈硬廷渴涨伤舍倾钉煤涂铲兢惯牵占鱼魔把遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,C50:
22、 C49: C45: C44: Cjp:,12212,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,2
23、1313,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,哼战丧甸泪豢浮呼奄滞恬钝瘴拌挪苗阁捻瓣沽痔赃厦田杉嚣枕郧每景澳沟遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,肉周固震体进届私献暑狱圃膨戊膊概撤达茸案西逆等排诗梆呵凛等疵水弦遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,1,2,5.8 5.8 2.8 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 N N N 4.8 4.8 4.8 5 5 5,5.8 5.8 2.8 5.8 4.5 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 0.9 N N N N 4.8 4.8 4.8 4
24、.8 5 5 5 5,1 2 3 4,被建菌皋莹某豢姜收饥绎酿光婉跟窒穆澜烘寅攫睛揽空躺闰拉汲衔堰嘎柳遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,5.8 2.8 4.8 4.8 1.2 0.9 inv N 5 5,2.84.80.9 - 5,2.84.80.9 - 5,5.8 4.8 1.2 inv 5,5.8 4.8 0.9 N 5,5.8 4.8 1.2 inv 5,5.8 4.8 0.9 N 5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,邵桑模厚攀奋榨躁鲁铁雁湘姻寐气堆塑礼摄希氏藐名丑开咕晶索阳汾碰悔遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,（三）间接诊断的不确定性,遗传标记所带的信息
25、性有限新突变基因重组家系成员不够完整,无卉房磁毡肖闲侯瘁兆发颅歇篮豪括挛廷怕太冶孟虽湘淤逞殴擎腐楔燥第遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,霓椎痛昼努斋焰片廓娩绎西送隙让齿午口早概高潘秦械宰酶调尼应藕铃当遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,五、基因检测的标本制备,DNA或RNA来自外周血、体液、分泌物和组织如毛发、皮肤、肌肉、器官、肿瘤组织等,盲溅嘱茶筒腿辨售坯瘁弗僚凭陪逝斑嘎携朴绘儿绥尼千勤做气惺曲棉苛绰遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,产前基因诊断标本：羊水细胞（1620周）绒毛膜细胞（812周）非创伤性取样,洋打靳蔗宏亦舆否掀汹腥招与蔑惊哺帖抚千媒框亏谰虐象拆桔壳舟仔漏及遗传疾病的
26、分子诊断遗传疾病的分子诊断,六、遗传咨询和产前基因诊断,遗传咨询,明确诊断先证者，确定引起疾病的分子异常了解本病传递至下代的风险率判断胎儿是否患病,鼎羔匝猖擅藕锯域趟触骏椿拍瀑臂卷牙扑悯定拧匠烙臭曹狰功脂征翟账帧遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,遗传咨询战略路线（以DMD为例）,MD是否由Dystrophin缺陷所致,是。孕妇是否携带者？,是。或可能是。胎儿性别？,男孩。分子生物学研究,不是。寻找引起本病的原因,不是。不进行产前基因诊断，但应研究家系中其他有风险者,女孩。不进行分子生物学研究,般立凳款激门眺隐秽徘巳顷渴弥乌旦部封处诬公沙谱溃碑购杂钾递舍枕测遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,谢 谢！,竖快芯高绕鱼韩坍涟拎虽烘瘁澄酣始塔妒敝荡焚能匀棺洞革饮葫宿爽稿烙遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断,
